w03細胞生物學研究方法(已修改)
2025-01-20 11:43 本頁面
【正文】 ?第三章 細胞生物學研究方法 一 、 細胞形態(tài)結構觀察 （ 一 ） 光學顯微鏡： ? 普通光鏡的性能指標：放大率 （ 放大倍數 ）分辨力 、 清晰度 、 焦點深度 、 鏡象亮度 。 ? 分辨力 （ 分辨率 、 分辨本領 ） ：能分辨兩個物點之間最短距離的能力 ， 通常是以分辨距離來表示的 ， 即分辨距離越小則分辨力越高 。 圖 21 尼康 E600 顯微鏡 ? 人肉眼分辨力測試是規(guī)定在明視距離25cm所分辨的最短間距來表示 ， 正常人肉眼分辨力的極限值是 (毫米 )， 顯微鏡的分辨力可按下列公式來計算 R=（ R 是分辨距離 ， ， λ是 照明光波波長 ， N〃A 是顯微鏡物鏡的鏡口率 —— 光學性能指標 ， 每個物鏡上都標有其鏡口率的數值 ） 。 ? ? ∵ 分辨距離 R與鏡口率 N〃A 成反比 ， ? ∴ 若把最大鏡口率 （ 即油鏡鏡口率 ）代入公式 ， 可以最小分辨距離 ≌ /2由于可見光中最短波長 （ 紫光 ） 為 （ 即 400nm） 。 ? ∴ 普通光鏡最大分辨力的理論極限為 ,請記住 ， 這個數值就是顯微鏡水平與亞（超）微水平的分界線。 ? ∵ 顯微鏡的分辨力是有一定的極限 ， ? ∴ 其放大率受分辨力制約而不可能無限提高 ， 普通光鏡放大率的經驗界值：有效放大倍數極限 =物鏡鏡口率 1000。 ? 例普通顯微鏡的油鏡鏡口率為 ,故此臺顯微鏡的最大有效放大倍數為 1250倍 。 ? 高級研究顯微鏡油鏡鏡口率為 ， 則此鏡的最大有效放大倍數為 1400倍 。 ? ? 如果放大倍數超過限度 ， 則視野中物象變模糊 ， 細微結構反倒分辨不清 ， 成為了無效放大 ， 由于物鏡鏡口率受入射鏡口角和介質折射率的限制 ， 不可能更大提高 ， 所以科學家們從兩個途徑來改進顯微鏡： ? ⅰ 、 換用短波長的照明光源提高分辨力 ， 如紫外光顯微鏡 ， 電子顯微鏡； ? ⅱ 應用特殊光學效應增強反差 ， 提高分辨能力 。 圖 21尼康 E600 顯微鏡 相差顯微鏡 （ phase contrast microscope） ? 用于沒有染色的活細胞 ? 原理：光波的三個光學特性 （ 1） 光波有波長 ， 對于光波波長變化 ， 肉眼覺察為顏色變化 （ 2） 光波有振幅 ， 對于光波振幅變化 （ 即振幅差 ） 肉眼覺察為明暗變化 （ 3） 光波有相位（ 相位是指某一時刻光在其前進路線上的位臵 ）對于光相位的變化 （ 即相位差 ） ， 肉眼不能覺察 。 圖 28 相差顯微鏡照明原理 ? 當光線穿過無色透明且非勻質的被檢物體 （ 例如活細胞 ） 其波長和振幅都無明顯變化 ， 僅光相位出現了一定程度變化 ， 此時觀察感覺反差小 ， 物體內部結構難分辨 ， 這就是普通光鏡不適宜用于觀察活細胞的原因 ， 相差顯微鏡卻是運用一些特殊裝臵 ， 使通過被檢物體的光線分離成兩組光波 ，并人為地使這兩組光波之間微弱的相位差加大 ， 再經過光波干涉作用 ， 使看不見的相位差轉變成可見的振幅差 ， 從而反差增強 ， 使能夠清晰看到被檢物體及其內部細微結構 ， 所以相差顯微鏡下的樣品不需染色 ， 可清晰觀察活細胞及其內部結構的變化 。 ? 特點：相差顯微鏡有正反差和負反差兩種類型 ， 正反差（ 暗反差 ） 觀察效果是被檢物質比周圍背景略暗 ， 物體外圍顯現一圈亮的光暈 ， 而負反差 （ 明反差 ） 的效果則是相反 。 圖 29 一種介殼蟲的染色體（ PCM 照片） ? 熒光顯微鏡 （ fluorescence microscope） ? 原理：以紫外光為光源 ， 使被檢材料中的熒光物質激發(fā)出熒光 ， 從而對細胞內某些物質進行定性和定位分析 ，熒光現象有兩種： （ 1） 自發(fā)熒光 —— 細胞內某些天然熒光物質被紫外光照射所激發(fā)的熒光 ， 例如葉綠素 —— 血紅色自發(fā)熒光 。 （ 2） 誘發(fā)熒光 —— 在細胞中加入某種不會使細胞化學組分變性的熒光染料 （ 熒光素 ） ， 與細胞內某種特定成分結合在一起 ， 經紫外光照射激發(fā)出熒光 。 ? 例：熒光染料吖啶橙 ， 可使 RNA 發(fā)出紅色熒光 ， 而使 DNA發(fā)出綠色熒光 。 圖 22尼康 E800 熒光 DIC 顯微鏡 圖 23落射式照明原理 圖 24 熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、 微絲紅色、核藍色） 特點：與普通光鏡在結構上不同之處是： ? （ 1） 采用紫外光發(fā)生裝臵 ， 高壓燈 +激發(fā)裝臵+濾光裝臵 。 ? （ 2） 透鏡由石英玻璃制成 ， 以便減少道路上的紫外光損耗 。 ? （ 3） 目鏡中裝壓紫濾片 （ 保護眼睛 ） 。 ? ? 熒光顯微鏡目前在分子細胞生物學研究中應用十分廣泛，以熒光素標記各種探針進行基因定位分析和對某些特異蛋白質進行定性定位檢測分析，靈敏清晰，在熒光顯微鏡下對樣品可同時采用兩種以上（有的多達 6~12種）熒光探針檢測，依據其不同顏色的熒光信號，我們能一次判斷識別多個基因位點，因此這是非常實用的研究技術，此外，由于在熒光標記檢測實驗中，易發(fā)生一些非檢測目標出現假象的“背景噪音”問題，因而現可在熒光顯微鏡設備上安裝一套“數字成像處理系統(tǒng) CCD” ，即把圖像信息通過攝像機和電腦的圖象數字化處理，使信號反差可以放大增強，對假象削弱 or削除從而明顯提高檢測的精確率和靈敏度。 ? 4. 倒臵顯微鏡： ?
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