w03細(xì)胞生物學(xué)研究方法(已修改)
2025-01-20 11:43 本頁面
【正文】 ?第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法 一 、 細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 （ 一 ） 光學(xué)顯微鏡： ? 普通光鏡的性能指標(biāo)：放大率 （ 放大倍數(shù) ）分辨力 、 清晰度 、 焦點(diǎn)深度 、 鏡象亮度 。 ? 分辨力 （ 分辨率 、 分辨本領(lǐng) ） ：能分辨兩個物點(diǎn)之間最短距離的能力 ， 通常是以分辨距離來表示的 ， 即分辨距離越小則分辨力越高 。 圖 21 尼康 E600 顯微鏡 ? 人肉眼分辨力測試是規(guī)定在明視距離25cm所分辨的最短間距來表示 ， 正常人肉眼分辨力的極限值是 (毫米 )， 顯微鏡的分辨力可按下列公式來計算 R=（ R 是分辨距離 ， ， λ是 照明光波波長 ， N〃A 是顯微鏡物鏡的鏡口率 —— 光學(xué)性能指標(biāo) ， 每個物鏡上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值 ） 。 ? ? ∵ 分辨距離 R與鏡口率 N〃A 成反比 ， ? ∴ 若把最大鏡口率 （ 即油鏡鏡口率 ）代入公式 ， 可以最小分辨距離 ≌ /2由于可見光中最短波長 （ 紫光 ） 為 （ 即 400nm） 。 ? ∴ 普通光鏡最大分辨力的理論極限為 ,請記住 ， 這個數(shù)值就是顯微鏡水平與亞（超）微水平的分界線。 ? ∵ 顯微鏡的分辨力是有一定的極限 ， ? ∴ 其放大率受分辨力制約而不可能無限提高 ， 普通光鏡放大率的經(jīng)驗(yàn)界值：有效放大倍數(shù)極限 =物鏡鏡口率 1000。 ? 例普通顯微鏡的油鏡鏡口率為 ,故此臺顯微鏡的最大有效放大倍數(shù)為 1250倍 。 ? 高級研究顯微鏡油鏡鏡口率為 ， 則此鏡的最大有效放大倍數(shù)為 1400倍 。 ? ? 如果放大倍數(shù)超過限度 ， 則視野中物象變模糊 ， 細(xì)微結(jié)構(gòu)反倒分辨不清 ， 成為了無效放大 ， 由于物鏡鏡口率受入射鏡口角和介質(zhì)折射率的限制 ， 不可能更大提高 ， 所以科學(xué)家們從兩個途徑來改進(jìn)顯微鏡： ? ⅰ 、 換用短波長的照明光源提高分辨力 ， 如紫外光顯微鏡 ， 電子顯微鏡； ? ⅱ 應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)增強(qiáng)反差 ， 提高分辨能力 。 圖 21尼康 E600 顯微鏡 相差顯微鏡 （ phase contrast microscope） ? 用于沒有染色的活細(xì)胞 ? 原理：光波的三個光學(xué)特性 （ 1） 光波有波長 ， 對于光波波長變化 ， 肉眼覺察為顏色變化 （ 2） 光波有振幅 ， 對于光波振幅變化 （ 即振幅差 ） 肉眼覺察為明暗變化 （ 3） 光波有相位（ 相位是指某一時刻光在其前進(jìn)路線上的位臵 ）對于光相位的變化 （ 即相位差 ） ， 肉眼不能覺察 。 圖 28 相差顯微鏡照明原理 ? 當(dāng)光線穿過無色透明且非勻質(zhì)的被檢物體 （ 例如活細(xì)胞 ） 其波長和振幅都無明顯變化 ， 僅光相位出現(xiàn)了一定程度變化 ， 此時觀察感覺反差小 ， 物體內(nèi)部結(jié)構(gòu)難分辨 ， 這就是普通光鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞的原因 ， 相差顯微鏡卻是運(yùn)用一些特殊裝臵 ， 使通過被檢物體的光線分離成兩組光波 ，并人為地使這兩組光波之間微弱的相位差加大 ， 再經(jīng)過光波干涉作用 ， 使看不見的相位差轉(zhuǎn)變成可見的振幅差 ， 從而反差增強(qiáng) ， 使能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu) ， 所以相差顯微鏡下的樣品不需染色 ， 可清晰觀察活細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化 。 ? 特點(diǎn)：相差顯微鏡有正反差和負(fù)反差兩種類型 ， 正反差（ 暗反差 ） 觀察效果是被檢物質(zhì)比周圍背景略暗 ， 物體外圍顯現(xiàn)一圈亮的光暈 ， 而負(fù)反差 （ 明反差 ） 的效果則是相反 。 圖 29 一種介殼蟲的染色體（ PCM 照片） ? 熒光顯微鏡 （ fluorescence microscope） ? 原理：以紫外光為光源 ， 使被檢材料中的熒光物質(zhì)激發(fā)出熒光 ， 從而對細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)進(jìn)行定性和定位分析 ，熒光現(xiàn)象有兩種： （ 1） 自發(fā)熒光 —— 細(xì)胞內(nèi)某些天然熒光物質(zhì)被紫外光照射所激發(fā)的熒光 ， 例如葉綠素 —— 血紅色自發(fā)熒光 。 （ 2） 誘發(fā)熒光 —— 在細(xì)胞中加入某種不會使細(xì)胞化學(xué)組分變性的熒光染料 （ 熒光素 ） ， 與細(xì)胞內(nèi)某種特定成分結(jié)合在一起 ， 經(jīng)紫外光照射激發(fā)出熒光 。 ? 例：熒光染料吖啶橙 ， 可使 RNA 發(fā)出紅色熒光 ， 而使 DNA發(fā)出綠色熒光 。 圖 22尼康 E800 熒光 DIC 顯微鏡 圖 23落射式照明原理 圖 24 熒光顯微鏡照片（微管呈綠色、 微絲紅色、核藍(lán)色） 特點(diǎn)：與普通光鏡在結(jié)構(gòu)上不同之處是： ? （ 1） 采用紫外光發(fā)生裝臵 ， 高壓燈 +激發(fā)裝臵+濾光裝臵 。 ? （ 2） 透鏡由石英玻璃制成 ， 以便減少道路上的紫外光損耗 。 ? （ 3） 目鏡中裝壓紫濾片 （ 保護(hù)眼睛 ） 。 ? ? 熒光顯微鏡目前在分子細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用十分廣泛，以熒光素標(biāo)記各種探針進(jìn)行基因定位分析和對某些特異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性定位檢測分析，靈敏清晰，在熒光顯微鏡下對樣品可同時采用兩種以上（有的多達(dá) 6~12種）熒光探針檢測，依據(jù)其不同顏色的熒光信號，我們能一次判斷識別多個基因位點(diǎn)，因此這是非常實(shí)用的研究技術(shù)，此外，由于在熒光標(biāo)記檢測實(shí)驗(yàn)中，易發(fā)生一些非檢測目標(biāo)出現(xiàn)假象的“背景噪音”問題，因而現(xiàn)可在熒光顯微鏡設(shè)備上安裝一套“數(shù)字成像處理系統(tǒng) CCD” ，即把圖像信息通過攝像機(jī)和電腦的圖象數(shù)字化處理，使信號反差可以放大增強(qiáng)，對假象削弱 or削除從而明顯提高檢測的精確率和靈敏度。 ? 4. 倒臵顯微鏡： ?
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