【正文】 陰離子的熒光蛋白探針cpYFP， 利用該定位于線粒體的超氧陰離子熒光探針，我們發(fā)現(xiàn)了新的線粒體超氧生成事件，并命名 “超氧炫 (superoxide flash)”。 承擔(dān)單位： 北京大學(xué)、北京師范大學(xué) 課題組長： 王世強(qiáng) 學(xué)術(shù)骨干： 崔宗杰 經(jīng)費(fèi)比例： 20% 課題 2 超氧炫與細(xì)胞 ROS 信號時空動態(tài) 研究 內(nèi)容 ： ROS 信號與細(xì)胞信號通路調(diào)節(jié)、應(yīng)激反應(yīng)、衰老、凋亡以及多種疾病密切相關(guān)，在生理和病理?xiàng)l件下都發(fā)揮重要作用。為此，本課題主要研究細(xì)胞鈣信號的微觀控制和時空自組織過程，包括鈣火花發(fā)生過程中 L 型鈣通道與鈣釋放通道間納米尺度局部控制、鈣火花通過鈣致鈣釋放自激形成螺旋鈣波和鈣振蕩的時空動態(tài)，同時與課題二合作研究細(xì)胞鈣信號時空動態(tài)與超氧信號的相互關(guān)系。團(tuán)隊中，生命科學(xué)專家提出關(guān)于生命活動信號調(diào)控的基本問題，并從分子、細(xì)胞到整體進(jìn)行實(shí)驗(yàn)研究；長期致力于生命過程研究的數(shù)學(xué)家以實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)為基礎(chǔ)，通過抽象、建模、仿真，對細(xì)胞信號時空過程的穩(wěn)態(tài)機(jī)制進(jìn)行理論升華；化學(xué)生物學(xué)家通過設(shè)計分子探針，實(shí)現(xiàn)信號分子的動態(tài)和相互作用研究；來自工學(xué)院的專家一方面為項(xiàng)目中成像技術(shù)和數(shù)據(jù)分析提供支撐，也將產(chǎn)生研究技術(shù)的自主創(chuàng)新成果。 本項(xiàng)目的顯著特色是多學(xué)科聯(lián)合攻關(guān)。要獲得突破 性進(jìn)展 ，很大程度上依賴于建立新技術(shù)和新方法。 （ 3） 研究方法的創(chuàng)新 。我們在總體研究思路上，實(shí)驗(yàn)與理論相結(jié)合、分析與綜合相結(jié)合、微觀與宏觀相結(jié)合、離體與在體相結(jié)合、隨機(jī)與穩(wěn)態(tài)相結(jié)合、科學(xué)探索與技術(shù)創(chuàng)新相結(jié)合。 細(xì)胞信號過程是一個多層次復(fù)雜 、動態(tài) 體系。這是基于我們以往對細(xì)胞信號隨機(jī)動態(tài)的深入研究，經(jīng)過多次跨學(xué)科研討，凝練出的科學(xué)問題，是生命科學(xué)、系統(tǒng)與控制科學(xué)、非線性物理科學(xué)領(lǐng)域共同關(guān)心的基本問題。 其 創(chuàng)新 性 主要體現(xiàn)在： （ 1）研究目標(biāo)的創(chuàng)新。為本項(xiàng)目攻關(guān)提供了強(qiáng)強(qiáng)聯(lián)合、優(yōu)勢互補(bǔ)的學(xué)術(shù)團(tuán)隊。 承擔(dān)本項(xiàng)目研究工作的中堅力量都是細(xì)胞 信號 動態(tài)研究、分子探針研究、 新一代 顯微成像和 多維 圖像處理 等相關(guān) 領(lǐng)域的學(xué)術(shù)帶頭人 ， 擁有卓著的研究成果和豐富的 研究經(jīng)驗(yàn)， 部分成員的研究在國際同領(lǐng)域居主導(dǎo)地位。 本項(xiàng)目提托中關(guān)村地區(qū)的學(xué)術(shù)環(huán)境優(yōu)勢，發(fā)揮綜合大學(xué)的多學(xué)科攻關(guān)優(yōu)勢，利用多個國家級研究基地的資源優(yōu)勢，包括生物膜與膜生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、分子科學(xué)國家實(shí)驗(yàn)室、生物大分子國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室等。 以單分子 米氏方程 為基礎(chǔ)建立單分子反應(yīng)模型， 進(jìn)一步 建立分子寡聚體系的數(shù)學(xué)動力學(xué)模型，通過 Monte Carlo 仿真獲得分子寡聚體系動態(tài)行為。 我們可以通過限速反應(yīng)、或某些 “限速 ”的網(wǎng)絡(luò)模塊 (module)，發(fā)展基于信號傳遞或 信息流的網(wǎng)絡(luò)分解方法。 通過數(shù)學(xué)建模，將實(shí)驗(yàn)事實(shí)與生物學(xué)規(guī)律聯(lián)系起來，通過對數(shù)據(jù)的擬合，建立細(xì)胞信使動態(tài)和穩(wěn)態(tài)相統(tǒng)一的理論 模型 。在分子水平 上 ，研究重要信號蛋白 的 動態(tài) 行為及相互作用 ； 在細(xì)胞 器水平 上， 研究鈣信號、 ROS 信號的動態(tài)及其與信號蛋白的相互作用 ； 在細(xì)胞 水平 上， 研究 鈣信號螺旋波，鈣信號與 ROS 信號相互 作用 ，信號蛋白的 空間定位和 調(diào)控 網(wǎng)絡(luò)等；在整體水平 上 ，將采用基因敲除鼠和轉(zhuǎn)基因鼠 方法， 研究信號蛋白的功能 及其整合調(diào)控關(guān)系。 通過系統(tǒng)優(yōu)化， 我們將 推動 探針技術(shù) 成為實(shí)驗(yàn)室常規(guī)技術(shù)，實(shí)現(xiàn)對信號蛋白及其 相互作用 的高時空分辨探測。開展 小分子 信使 （如離子、 ROS等）的檢測及其生物學(xué)功能 研究；發(fā)展 SRET技術(shù)，實(shí)現(xiàn)檢測多個蛋白相互作用的調(diào)控機(jī)理 研究 。我們將 在 “大腸桿菌 哺乳細(xì)胞 ”穿梭體系和分子進(jìn)化平臺的基礎(chǔ)之上，構(gòu)建新穎的高通量變異體篩選庫， 實(shí)現(xiàn) 非天然氨基酸 分子標(biāo)記 。用獨(dú)立成分分析以及去卷積計算細(xì)胞信號的時空序列。我們將自行研制 STED系統(tǒng)用于空間高分辨成像，研制 CARS和 SRS 系統(tǒng)用于非熒光探針成像。 細(xì)胞信號成像將采用激光共聚焦顯微成像系統(tǒng) 。我們的前沿探索將對顯微成像技術(shù)、分子探針、多維圖像算法等提出較高的需求，因此將發(fā)揮項(xiàng)目組成員的多學(xué)科優(yōu)勢實(shí)現(xiàn)新模態(tài)、高分辨、高通量成像技術(shù)的自主創(chuàng)新。一方面是針對參與鈣信號和 ROS 相互作用的關(guān)鍵蛋白，利用基因敲除、定點(diǎn)突變等遺 傳干預(yù)手段“牽一發(fā)而動全身”，通過單因素變化導(dǎo)致的多因素變化來推斷多信號體系內(nèi)的調(diào)控關(guān)系；另一方面在大量時空動態(tài)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上構(gòu)建數(shù)學(xué)模型，從控制原理和優(yōu)化理論的角度研究系統(tǒng)的性質(zhì)，揭示微觀隨機(jī)信號形成系統(tǒng)穩(wěn)健性的原理。這三個方面在思路上以分析為主。 三、研究方案 1. 總體學(xué)術(shù)思路： 首先，我們基于以往突破性進(jìn)展的基礎(chǔ)，繼續(xù)深入研究細(xì)胞鈣信號和超氧炫的時空動態(tài)及其調(diào)控機(jī)制。 5. 培養(yǎng)碩士博士 研究生 60～ 80 名，博士后 10～ 20 名，國家杰出青年基金獲得者、教育部“長江學(xué)者 ” 、中科院“百人計劃”等學(xué)術(shù)帶頭人 48 名 。 五年預(yù)期目標(biāo) : 1. 在現(xiàn)有的基礎(chǔ)上，建立完善 的信號時空動態(tài)實(shí)驗(yàn)體系 ，重點(diǎn)加強(qiáng)高分辨、新模態(tài)顯微成像 和 分子探針 平臺， 發(fā)展顯微圖像實(shí)時處理和三維重構(gòu)技術(shù)，爭取實(shí)現(xiàn)若干關(guān)鍵技術(shù)的自主創(chuàng)新； 2. 闡明 細(xì)胞 鈣信號納米尺度局部控制機(jī)制和鈣 穩(wěn)態(tài)維持條件。 項(xiàng)目名稱： 細(xì)胞信號時空動態(tài)的前沿研究和關(guān)鍵技術(shù) 首席科學(xué)家： 王世強(qiáng) 北京大學(xué) 起止年限： 至 依托部門： 教育部 二、預(yù)期目標(biāo) 本項(xiàng)目的總體目標(biāo)： 我們將在深入分析細(xì)胞鈣信號、線粒體 ROS 信號與關(guān)鍵蛋白的時空動態(tài)活動的基礎(chǔ)上，運(yùn)用實(shí)驗(yàn)分析和理論建模相結(jié)合的方法系統(tǒng)地分析信號間相互調(diào)節(jié)、相互控制的關(guān)系，闡明細(xì)胞信號微觀隨機(jī)動態(tài)呈現(xiàn)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)的基本原理，并有重點(diǎn)地揭 示有關(guān)病理?xiàng)l件下信號系統(tǒng)失穩(wěn)態(tài)的機(jī)制， 為基于 細(xì)胞 信號 的 藥物創(chuàng)新 提供理論基礎(chǔ)。 分子 機(jī)制的 異常 可造成 突觸 形成和 神經(jīng)環(huán)路功能 的異常 ，導(dǎo)致 腦功能（如記憶和 學(xué)習(xí) ）損傷和失常 。 主要研究內(nèi)容 ： 1. 工作記憶的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制 ； 2. 抉擇行為的神經(jīng)環(huán)路機(jī)制 ； 3. 工作記憶和抉擇行為的神經(jīng)環(huán)路的理論模型 。工作記憶所儲存的信息包括抉擇時刻的外部刺激、動物本身的需求和相關(guān)的回憶，是動物做出合理抉擇的關(guān)鍵；反之，抉擇行為的結(jié)果又決定了動物工作記憶的內(nèi)容和模式，并將行為的后果存入 及 更替過去的 記憶。 主要研究內(nèi)容 ： 1. 神經(jīng)信息的產(chǎn)生與傳 遞的調(diào) 控與可塑性機(jī)制， 包括 神經(jīng)元的動作電位產(chǎn)生和傳導(dǎo) ， 神經(jīng) 遞質(zhì)與感覺刺激 對 信息產(chǎn)生與傳遞 的 調(diào)控 ； 2. 視覺、嗅覺、聽覺和味覺之間的調(diào)控與整合的突觸和環(huán)路機(jī)制 ， 及 其 在動物行為中 的功能 ； 3. 皮層 神經(jīng)環(huán)路學(xué)習(xí)和存儲視覺經(jīng)驗(yàn)中時序信息的 機(jī)制。 課題三 神經(jīng)環(huán)路信號傳遞、整合與儲存 研究神經(jīng)環(huán)路中信息傳遞、整合與儲存的機(jī)制有助于我們深入理解腦的工作原理以及動物行為產(chǎn)生的機(jī)制。 本課題的關(guān)鍵問題 ： 1） 神 經(jīng)元形態(tài)發(fā)生的分子機(jī)制； 2） 發(fā)育過程中 神經(jīng) 元 活動依賴的樹突和突觸的修剪機(jī)制。 主要研究內(nèi)容 ： 1. 大腦皮層 和脊髓背角神經(jīng)元產(chǎn)生及神經(jīng)遞質(zhì)表型決定的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī) 制； 2. miRNA 在大腦皮層神經(jīng)細(xì)胞命運(yùn)決定、定向遷移、軸樹突分化、軸突生長導(dǎo)向中的作用 ； 3. 大腦皮層及脊髓神經(jīng)元有序遷移及軸突投射的導(dǎo)向機(jī)制 。 細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)錄因子和 miRNA 及胞外誘導(dǎo)因子對這些發(fā)育環(huán)節(jié)發(fā)揮重要的調(diào)控作用。以下將按課題順序敘述擬解決的關(guān)鍵科學(xué)問題和主要研究內(nèi)容。 1. 初步取得一些基因是如何調(diào)控神經(jīng)干細(xì)胞激活或沉默的的數(shù)據(jù)； 2. 基本完成 SCF/cKit對皮質(zhì)丘腦束發(fā)育調(diào)控作用的研究，整理并撰寫論文； 3. 整理脊髓背 角神經(jīng)元環(huán)路方面的工作 ； 4. 完成神經(jīng)電活動調(diào)節(jié)樹突、樹突棘修剪機(jī)制的研究；明確 MeCP2的作用機(jī)制 ； 5. 整理數(shù)據(jù)、撰寫并發(fā)表論文 ； 6. 揭示網(wǎng)絡(luò)活動狀態(tài)在 感覺信息整合中的作用機(jī)制； 揭示視覺 聽覺整合的動態(tài)調(diào)節(jié)機(jī)制及其行為意義 ； 7. 找到介導(dǎo)果蠅味嗅覺整合的神經(jīng)環(huán)路；闡明初級視皮層時序?qū)W習(xí)與記憶的神經(jīng)機(jī)制 ； 8. 闡明工作記憶和持續(xù)性發(fā)放中單個細(xì)胞與群體細(xì)胞活動的關(guān)系，闡明猴神經(jīng)元在工作記憶中的群體活動規(guī)律 ； 9. 完善神經(jīng)環(huán)路模型，用模型解釋所觀察到的所有的實(shí)驗(yàn)現(xiàn)象；了解壓力環(huán)境對群體抉擇行為的影響以及相應(yīng)的神經(jīng)環(huán)路基礎(chǔ) ； 10. 闡明 MeCP2 和 CDKL5 突變致認(rèn)知功能異常的細(xì)胞學(xué)基礎(chǔ)，提出對 AD 發(fā)病機(jī)理的新認(rèn)識，闡明 GABA 系統(tǒng)與精神分裂癥發(fā)病機(jī)理的關(guān)系；揭示 ASIC 敏感化調(diào)控的分子基礎(chǔ)并發(fā)現(xiàn)缺血性神經(jīng)損傷和慢性痛治療新靶點(diǎn) ； 11． 總結(jié)結(jié)果，發(fā)表論文。 TRPC6 通過下調(diào) Aβ 的產(chǎn)生減少其對突觸的毒性，改善了行為 。探討成年神經(jīng)干細(xì)胞維持，沉默，以及激活的調(diào)控方式； 2. 離體實(shí)驗(yàn)研究 SCF 是否通過cKit促進(jìn)皮層深層神經(jīng)元軸突的黏附生長； 3. 繼續(xù)完善與優(yōu)化脊髓背角神經(jīng)元環(huán)路分析方法。完善工作記憶的神經(jīng)元環(huán)路模型 ； 9. 闡明 MeCP CDKL5 和 UBE3A突變致神經(jīng)環(huán)路發(fā)育異常的機(jī)制，闡明 TRPC6 調(diào)控分泌酶，確定 AD鼠中 TRPC6通道對學(xué)習(xí)和記憶的影響 ； 10. 確認(rèn) GAT1 對小鼠類精分癥狀的影響，明確 BDNF/TrkBASIC 調(diào)控途徑在痛信號傳遞和維持過程中作用的重要性 。初步 建立用于神經(jīng)干細(xì)胞研究的體內(nèi)疾病模型 ； 2. 初步確定 SCF/cKit 是否參與皮質(zhì) ——丘腦束發(fā)育的調(diào)控 ； 3. 完成 Calpain 和 Caspase3 完成新篩選出基因?qū)渫话l(fā)育與突觸功能的調(diào)節(jié)作用的研究 ； 4. 確證 MeCP2 上下游分子是否參與樹突棘發(fā)育與修剪的過程；整理數(shù)據(jù)、撰寫并發(fā)表論文 ； 5. 闡明神經(jīng)調(diào)質(zhì)對突觸可塑性的調(diào)節(jié)作用及機(jī)制；揭示中腦視覺和聽覺整合的功能特點(diǎn) ； 6. 發(fā)現(xiàn)視覺模式對嗅覺反應(yīng)的調(diào)控機(jī)制；揭示不同生理狀態(tài)下視覺知覺記憶鞏固的機(jī)制 ； 7. 闡明學(xué)習(xí)如何改變工作記憶和持續(xù)性發(fā)放以及相關(guān)神經(jīng)元活動。探討各種工作記憶機(jī)制的合理性 ； 9. 研究 敲除 ErbB4 基因的小鼠的突觸傳遞， MeCP2 和 CDKL5 敲除小鼠的學(xué)習(xí)行為， 研究過表達(dá)TRPC6 通道影響 g 分泌酶的活性，檢測 AD 鼠中過表達(dá) TRPC6通道對學(xué)習(xí)和記憶能力 ； 10. 檢測 GAT1 敲除小鼠類精分癥狀的作用 , ASIC 如何參與 BDNF 對于神經(jīng)環(huán)路的調(diào)節(jié)作用。 1. 完成 Ezh2 對神經(jīng)元產(chǎn)生和發(fā)育的調(diào)控方式，整理撰寫論文 ； 2. 確定 NP1 及 NP2 如何指導(dǎo)脊髓背角神經(jīng)元軸樹突的生長投射，整理并撰寫論文 ； 3. 完成 Rab10 對神經(jīng)元極化作用機(jī)理研究；完成在體檢測Ncadherin 功能的轉(zhuǎn)基因小鼠的構(gòu)建 ； 4. 完成不同腦區(qū)神經(jīng)元的形態(tài)發(fā)生鑒定，初步得到 MeCP2 調(diào)控樹突棘發(fā)育的體內(nèi)證據(jù)；整理數(shù)據(jù)、撰寫論文 ； 5. 揭示神經(jīng)調(diào)質(zhì)對軸突 Na+通道的調(diào)制作用及其機(jī)制；揭示視覺 輸入的動態(tài)門控機(jī)制和行為意義 ； 6. 發(fā)現(xiàn)果蠅味覺和嗅覺整合的整合位點(diǎn)；發(fā)現(xiàn)參與 V1 時序?qū)W習(xí)與記憶的神經(jīng)環(huán)路 ； 7. 深入闡明工作記憶相關(guān)環(huán)路的連接方式，了解蘑菇體的小葉對感覺刺激和獎懲刺激編碼的一般原則 ； 8. 建立猴的工作記憶行為范式，完善描述腦的抉擇行為的神經(jīng)環(huán)路模型 ； 9. 闡明 MeCP2， CDKL5 和 Ube3A在神經(jīng)元發(fā)育中的作用， 確定分泌酶或降解酶 的作用 ； 10. 明確 Ca2+信號及其下游通路在慢性痛誘發(fā)和維持中的作用，研究精胺增強(qiáng) ASIC 對神經(jīng)元興奮性的影響 。觀察在氣味編碼、強(qiáng)化學(xué)習(xí)及抉擇等神經(jīng)過程中與多巴胺能神經(jīng)元的活動相關(guān)聯(lián)的蘑菇體小葉興奮模式的變化 ； 8. 建立猴等模式動物的工作記憶范式。確定神經(jīng)細(xì)胞中是否存在細(xì)胞特異性基因組 DNA 重組； 3. 明確遷移神經(jīng)元中極性黏附建立的機(jī)制，整理撰寫論文； 4. 明確 Rab10 等小 G蛋白的可能作用機(jī)制； 5. 完成對基因芯片篩選出的基因的鑒定與確認(rèn)；獲得 MeCP2 轉(zhuǎn)基 6 小鼠模型 ； 6. 探討抑制性中間神經(jīng)元的動作電位產(chǎn)生和傳播機(jī)制，揭示間腦多巴