【正文】 去三十多 年的不懈探索，細(xì)胞鈣信號(hào)的微觀性質(zhì)已經(jīng)逐步闡明，但這些信號(hào)如何控制并產(chǎn)生復(fù)雜的胞內(nèi)動(dòng)態(tài)行為尚知之甚少，限制了對(duì)有關(guān)生理和病理過程的深入認(rèn)識(shí)。 研究目標(biāo)： 本課題的總體目標(biāo)是闡明細(xì)胞鈣信號(hào)納米尺度局部控制機(jī)制和細(xì)胞鈣信號(hào)自組織機(jī)制，闡明單線態(tài)氧分子等超氧信號(hào)與細(xì)胞鈣振蕩的相互作用 ，從而對(duì)細(xì)胞鈣信號(hào)異常如何導(dǎo)致心律失常等重大疾病這一長期未能闡明的問題提供新的分子病理機(jī)制。盡管 ROS 信號(hào)研究歷史悠久，制約 ROS 信號(hào)動(dòng)態(tài)研究的主要原因是缺少特異性好、靈敏度高的ROS 探針。本研究將在此研究成果基礎(chǔ)上，進(jìn)一步發(fā)展在體實(shí)時(shí)探測(cè) ROS 技術(shù)，并結(jié)合代謝模式轉(zhuǎn)變的疾病動(dòng)物模型，深入探討 ROS 信號(hào)時(shí)空特性及其分子調(diào)控機(jī)制，從新的視野研究 ROS 信號(hào)的病理生理意義。 承擔(dān)單位： 北京大學(xué) 課題 組長 ： 張 晨 學(xué)術(shù) 骨干： 程和平、吳蓓 經(jīng)費(fèi)比例： 16% 課題 3 鈣和 ROS 通路關(guān)鍵信號(hào)蛋白的可視化分析 研究內(nèi)容 ： 本課題將以細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白為研究對(duì)象， 結(jié)合超高分辨率熒光成像、熒光相關(guān)光譜分析等技術(shù)， 著重 考察 鈣致鈣釋放信號(hào)蛋白復(fù)合體、 AdR 募集不同亞型磷酸二酯酶、 ROS 激活 caspase 和鈣依賴性蛋白激酶等過程 關(guān)鍵蛋白的動(dòng)態(tài)和相互作用，闡釋關(guān)鍵信號(hào)蛋白相互調(diào)控的分子機(jī)制。 系統(tǒng)優(yōu)化的蛋白質(zhì)特異標(biāo)記技術(shù)也將為我國蛋白質(zhì)研究提供一個(gè)新的獨(dú)特的研究方法。要維持細(xì)胞的正常功能，上 述膜通道、受體、調(diào)節(jié)蛋白間構(gòu)成相互調(diào)控的穩(wěn)態(tài)體系。 研究 目標(biāo)： 闡明 、 junctin、 yap、 DJ CALHM1~2 在調(diào)控鈣信號(hào)和 ROS 信號(hào)協(xié)同穩(wěn)態(tài)中的作用及分子機(jī)制，并闡明這信號(hào)蛋白調(diào)控異常與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；揭示心肌和血管平滑肌細(xì)胞鈣信號(hào)、 ROS 信號(hào)與相關(guān)關(guān)鍵 信號(hào)蛋白間的整合調(diào)控關(guān)系；在整體動(dòng)物上驗(yàn)證細(xì)胞多信號(hào)失調(diào)及鈣信號(hào)紊亂與相關(guān)疾病的關(guān)系，并為發(fā)展防治相關(guān)疾病的藥物創(chuàng)新提供理論基礎(chǔ)?；罴?xì)胞是非常復(fù)雜的系統(tǒng)；盡管生物分子在細(xì)胞內(nèi)的行為具有個(gè)體瞬時(shí)的隨機(jī)性，然而細(xì)胞功能具有系統(tǒng)的穩(wěn)健性。 研究 目標(biāo)： （ 1）建立信號(hào)分子寡聚體系隨機(jī)動(dòng)力學(xué)理論模型，闡釋信號(hào)分子微觀隨機(jī)性與細(xì)胞信號(hào)系統(tǒng)介觀穩(wěn)健性的關(guān)系；（ 2）建立細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)的數(shù)學(xué)模型，闡明其形成、傳遞、演變和終止的非線性動(dòng)力學(xué)機(jī)制。 承擔(dān)單位： 北京大學(xué) 課題 組長 ： 姜 明 學(xué)術(shù)骨干： 陶樂天、姚遠(yuǎn)、楊建生 經(jīng)費(fèi)比例： 12% 課題 6 新模態(tài)、高分辨、高通量時(shí)空動(dòng)態(tài)研究新技術(shù) 研究內(nèi)容 ： 本課題 “新模態(tài)、高分辨率、高通量時(shí)空動(dòng)態(tài)研究新技術(shù) ”的研究集中于發(fā)展與細(xì)胞信號(hào)時(shí)空動(dòng)態(tài)觀測(cè)相關(guān)的幾個(gè)關(guān)鍵技術(shù)，用以定量化揭示細(xì)胞生命活動(dòng)機(jī)制中的關(guān)鍵問題。 研究目標(biāo)： 通過和項(xiàng)目中其他課題的密切合作，開發(fā)和發(fā)展新的研究手段和方法，重點(diǎn)提供以高通量可視化的蛋白基因篩選、關(guān)鍵信號(hào)分子的非標(biāo)記三維顯微成像、熒光動(dòng)態(tài)信號(hào)的圖像處理為基礎(chǔ)的新方法， 為整個(gè)項(xiàng)目提供技術(shù)支撐，同時(shí)產(chǎn)生具有我國自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的細(xì)胞信號(hào)研究新技術(shù) 。 其中，課題一、二在我們以往突破性進(jìn)展的基礎(chǔ)上繼續(xù)深入研究細(xì)胞鈣信號(hào)和超氧炫的時(shí)空動(dòng)態(tài)及其調(diào)控機(jī)制，是整個(gè)項(xiàng)目實(shí)現(xiàn)突破的基礎(chǔ)。這三個(gè)課題構(gòu)成了對(duì)微觀信號(hào)時(shí)空動(dòng)態(tài)的系統(tǒng)分析。 課題六從成像技術(shù)和多維圖像算法方面為整個(gè)項(xiàng)目提供技術(shù)支撐，同時(shí)產(chǎn)生研究相關(guān)技術(shù)的自主創(chuàng)新成果。 2. 建立不同組織特異性表達(dá)超氧陰離子熒光蛋白探針 cpYFP 的轉(zhuǎn)基因小鼠，和在體實(shí)時(shí)、原位監(jiān)測(cè)超氧炫信號(hào)的技術(shù)平臺(tái)。 4. 應(yīng)用基因編碼熒光蛋白技術(shù)體系，建立有關(guān)信號(hào)分子的組織特異性基因編碼熒光蛋白探針表達(dá)動(dòng)物模型。 6. 針對(duì) ROS 代謝信號(hào)分子，合成或者制備相應(yīng) ROS 分子的檢測(cè)探針，并進(jìn)行驗(yàn)證；制備 ROS代謝相關(guān)的 siRNA；建設(shè) CARS顯微鏡系統(tǒng)；研究比較在共聚焦成像條件下活體細(xì)胞熒光微粒的熒光分布特征，通過引入非高斯分布參數(shù)的方法，探索高精度定位的方法。 2. 建立不同組織特異性表達(dá)cpYFP 的轉(zhuǎn)基因小鼠，并利用激光共聚焦顯微成像技術(shù)，在體水平檢測(cè)到不同組織的超氧炫信號(hào)。 4. 成功獲取 23 個(gè)與調(diào)控細(xì)胞鈣信號(hào)相關(guān)蛋白的遺傳干預(yù)小鼠動(dòng)物模型和可遺傳分子探針的動(dòng)物模型。 6. 建立篩選 ROS 代謝相關(guān)基因的細(xì)胞模型。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 二 年 1. 研究肌質(zhì)網(wǎng)鈣釋放通道突變對(duì)鈣火花和螺旋鈣波時(shí)空動(dòng)力學(xué)特性，螺旋鈣波的產(chǎn)生和發(fā)展的影響；研究細(xì)胞 ROS 信號(hào)的產(chǎn)生，對(duì)細(xì)胞 胞漿鈣振蕩發(fā)生及其振蕩模式的影響。 2. 利用 cpYFP 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，給予不同的處理，以改變其代謝狀態(tài)，觀察心肌、骨骼肌和肝臟中超氧炫信號(hào)的特性的變化，闡明超氧炫信號(hào)與代謝狀態(tài)的關(guān)系，揭示超氧炫信號(hào)的生理意義。 4. 在基因編碼熒光蛋白平滑肌和線粒體特異表達(dá)的小鼠模型上分析鈣信號(hào)和超氧炫的時(shí)空特性及在高血壓過程中的變化規(guī)律。 6. 利用已有和公用軟件，對(duì)篩選信息的進(jìn)行整理和分析；完成 2020次篩選；建設(shè) SRS 顯微鏡系統(tǒng)；采用基 于數(shù)字 體相 關(guān) (Digital Volume Correlation, DVC)技術(shù)的圖像模式識(shí)別方法，實(shí)現(xiàn)對(duì)共聚焦熒光圖像的自動(dòng)分割、識(shí)別、匹配，利用小波分析的方法，對(duì)背景噪聲進(jìn)行局部消除。 2. 闡明超氧炫信號(hào)在不同的代謝狀態(tài)下顯示不同的特性，超氧炫信號(hào)是與代謝相關(guān)聯(lián)的生理信號(hào) 。 4. 揭示心肌和血管平滑肌細(xì)胞鈣信號(hào)、 ROS 信號(hào)與相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)蛋白間的整合調(diào)控關(guān)系，以及鈣信號(hào)穩(wěn)態(tài)失調(diào)所致相關(guān)疾病的分子機(jī)制。 6. 找到 三到五個(gè)新的 ROS 代謝調(diào)控因子，并利 用 Northern、Western 等方法進(jìn)行驗(yàn)證；對(duì)相干拉曼光譜的激發(fā)光進(jìn)行調(diào)制，實(shí)現(xiàn)受激拉曼散射，完成 SRS顯微鏡的建設(shè)，并利用 SRS 顯微鏡對(duì)脂類分子和亞細(xì)胞脂肪顆粒實(shí)現(xiàn)非標(biāo)記實(shí)時(shí)定量圖像檢測(cè)；實(shí)現(xiàn)噪聲背景下共聚焦目標(biāo)熒光圖像的快速識(shí)別、匹配。 2. 利用 cpYFP 轉(zhuǎn)基因小鼠模型，在體監(jiān)測(cè)代謝疾病小鼠骨骼肌中的超氧炫信號(hào)變化，研究 ROS 信號(hào)在代謝疾病的作用，并研究大腦神經(jīng)元中超氧炫信號(hào)的變化，探討超氧炫信號(hào)在診斷、治療代謝和神經(jīng)疾病中的作用。 4. 應(yīng)用基因打靶、基因編碼等技術(shù)，通過對(duì)細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)進(jìn)行遺傳干預(yù)，研究細(xì)胞生命活動(dòng)過程的分子機(jī)制，分析信號(hào)間的調(diào)控關(guān)系。 6. 完成總共 5000 次篩選；詳細(xì)研究兩到三個(gè)功能基因的分子作用機(jī)制；利用 CARS 和 SRS 顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞的實(shí)時(shí)動(dòng)態(tài)觀察；研究提高共聚焦圖像分辨率的圖像處理方法。了解 ROS 單線 態(tài) 氧 分 子 對(duì) 細(xì) 胞Ca2+ATPase 的氧化修飾調(diào)節(jié) 。 3. 實(shí)現(xiàn)小分子探針對(duì)鈣離子信號(hào)的可視化標(biāo)記；確定鈣信號(hào)發(fā)生的精確位置。 5. 改進(jìn)的廣義米氏模型；刻畫廣義米氏模型介觀穩(wěn)定性的控制和優(yōu)化參數(shù)；數(shù)據(jù)驅(qū)動(dòng)的細(xì)胞信號(hào)動(dòng)態(tài)數(shù)學(xué)模型的模型參數(shù)和分布函數(shù)的確定方法。 研究內(nèi)容 預(yù)期目標(biāo) 第 四 年 1. 研究鈣小星觸發(fā)鈣火花過程中鈣釋放通道的時(shí)空募集過程，建立隨機(jī)動(dòng)力學(xué)模型；研究 ROS 單線態(tài)氧分子對(duì)細(xì)胞線粒體攝鈣蛋白的特異性調(diào)節(jié)，及其所導(dǎo)致的胞漿鈣振蕩變化。 2. 利用高通量 RNA 干擾技術(shù)和生物信息學(xué)手段，通過在整個(gè)基因組水平干擾基因的表達(dá)，尋找超氧炫信號(hào)的調(diào)控分子，并建立調(diào)控超氧炫信號(hào)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。 4. 應(yīng)用基因敲除、 RNAsi 等遺傳干預(yù) 技 術(shù) ， 研 究 、junctin、 Yap. DJ1 對(duì) Ca2+及ROS 的調(diào)控及分子機(jī)制 ，以及Ca2+ 和 ROS 信號(hào)失調(diào)與相關(guān)疾病發(fā)生的機(jī)制。 6. 分析確定功能基因與已知信號(hào)分子的相互關(guān)系，闡釋它們?cè)谛盘?hào)通路的作用；開始建立 動(dòng)物腫瘤模型；利用 SRS 顯微鏡進(jìn)行活細(xì)胞高分辨快速動(dòng)態(tài)過程的觀察；與熒光探針配合，研究細(xì)胞鈣、 ROS 信號(hào)的時(shí)空動(dòng)態(tài)分子影像。 2. 得到參與調(diào)控超氧炫信號(hào)的一系列蛋白，并利用生物信息學(xué)手段，建立所篩選到蛋白的網(wǎng)絡(luò)調(diào)控結(jié)構(gòu) 。 4. 闡明 、 junctin、 yap、DJ CALHM1~2 在調(diào)控鈣信號(hào)和 ROS 信號(hào)協(xié)同穩(wěn)態(tài)中的作用及分子機(jī)制，并闡明這信號(hào)蛋白調(diào)控異常與疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 6. 完成動(dòng)物腫瘤模型的建立；實(shí)現(xiàn)視頻幀率（大于 25 幀 /秒）的高分辨動(dòng)態(tài) SRS 顯微觀察；利用圖像處理及可視化軟件，初步勾勒出細(xì)胞信號(hào)蛋白的時(shí)空動(dòng)態(tài)信息。 2. 利用細(xì)胞生物學(xué)及分子生物學(xué)手段，選擇超氧炫信號(hào)的關(guān)鍵分子進(jìn)行功能研究，解析其詳細(xì)的調(diào)控機(jī)制，進(jìn)一步了解超氧炫信號(hào)的分子機(jī)制。 4. 應(yīng)用電生理、顯微成像等技術(shù)方法，利用遺傳干預(yù)動(dòng)物模型在器官和活體動(dòng)物上研究鈣信號(hào)調(diào)節(jié)相 關(guān)蛋白功能，以及這些蛋白失調(diào)所致疾病。 6. 在動(dòng)物模型驗(yàn)證分子機(jī)理；利用SRS 顯微鏡進(jìn)行模式動(dòng)物的高分辨快速動(dòng)態(tài)過程的觀察；在前期實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步優(yōu)化共聚焦熒光圖像處理算法。闡明溶酶體鈣通道蛋白甲 硫氨酸殘基氧化還原作用 。 3. 系統(tǒng)優(yōu)化蛋白質(zhì)特異標(biāo)記技術(shù)；為全國蛋白質(zhì)研究提供一個(gè)全新的獨(dú)特的研究方法。 5. 針對(duì)細(xì)胞鈣信號(hào)、線粒體 ROS 信號(hào)及相關(guān)關(guān)鍵信號(hào)蛋白構(gòu)成的信號(hào)體系，闡釋信號(hào)分子寡聚體系的介觀穩(wěn)健性的原理；闡明細(xì)胞信號(hào)的形成、傳遞、演變和終止的動(dòng)力學(xué)機(jī)制。 一、研究內(nèi)容 研究細(xì)胞信號(hào)時(shí)空動(dòng)態(tài)的根本目的并不在于信號(hào)的時(shí)空特征本身，而是通過對(duì)時(shí)空特征的了解，闡述生命活動(dòng)的基本機(jī)制 。例如鈣小星觸發(fā)鈣火花的過程是毫秒時(shí)間尺度的隨機(jī)過程；超氧炫展示的氧自由基爆發(fā)是秒時(shí)間尺度的，也是隨機(jī)的；信號(hào)蛋白的運(yùn)動(dòng)軌跡、與底物的結(jié)合解離都具有隨機(jī)性。例如心肌細(xì)胞一次 鈣瞬變持續(xù)時(shí)間及其決定的收縮力大小十分穩(wěn)定；細(xì)胞分裂的速度以及個(gè)體成長的進(jìn)程有準(zhǔn)確的時(shí)鐘；細(xì)胞分化后什么基因打開、什么基因關(guān)閉的錯(cuò)誤率極低。 微觀過程的隨機(jī)性如何整合為系統(tǒng)的穩(wěn)健性是生命科學(xué)、系統(tǒng)與控制科學(xué)、非線性物理科學(xué)共同關(guān)心的基本問題，也是需要多學(xué)科共同協(xié)作才能解決的問題。 這個(gè)關(guān)鍵問題可按層次分為三個(gè)子問題： 1． 鈣信號(hào)、 ROS 信號(hào)各自的微觀隨機(jī)動(dòng)態(tài)與自身穩(wěn)態(tài)； 2． 關(guān)聯(lián)鈣信號(hào)、 ROS 信號(hào)的關(guān)鍵信號(hào)蛋白的行為動(dòng)態(tài)； 3． 多信號(hào)系統(tǒng)如何通過信號(hào)蛋白交互作用實(shí)現(xiàn)系統(tǒng)穩(wěn)態(tài)。產(chǎn)生鈣小星的細(xì)胞膜 LCC 與產(chǎn)生鈣火花的 RyR 之間只有 12 納米，而緊密排列的 RyR 分子之間有 25 納米。因此，我們將研究是什么機(jī)制將鈣信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)限定在 12 納米的距離之內(nèi)，闡釋這種納米尺度局部控制對(duì)細(xì)胞鈣穩(wěn)態(tài)有何重要意義。健康的心肌細(xì)胞保持鈣穩(wěn)態(tài)，不產(chǎn)生鈣波。因此我們將研 究 RyR 之間通過 CICR 產(chǎn)生螺旋波的時(shí)空動(dòng)態(tài)機(jī)制，揭示兒茶酚胺如何通過 AdR 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)導(dǎo)致螺旋波發(fā)生，造成胞內(nèi)鈣信號(hào)失穩(wěn)態(tài)。在本項(xiàng)目中，我們將深入研究超氧炫的產(chǎn)生頻率、動(dòng)力學(xué)特征，以及代謝底物、胰島素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等影響代謝的因素對(duì)超氧炫的動(dòng)態(tài)調(diào)控 ， 闡明ROS 信號(hào)保持穩(wěn)態(tài)的基本條件和影響因素。交感神經(jīng)緊張?jiān)斐?AdR過度激動(dòng)，是引發(fā)心衰等過程中線粒體代 謝模式異常的原因之一。 3. 鈣和 ROS 信號(hào)與其它關(guān)鍵信號(hào)蛋白的 動(dòng)態(tài) 相互作用 鈣信號(hào)系統(tǒng)與線粒體 ROS 系統(tǒng)共處于相互調(diào)控的體系，它們都受包括 AdR在內(nèi)的其它信號(hào)系統(tǒng)調(diào)控，也調(diào)控其它信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。因此，本項(xiàng)目將研究調(diào)控 鈣和 ROS 信號(hào) 的關(guān)鍵蛋白在 AdR 激動(dòng)下的募集、轉(zhuǎn)位和寡聚化的時(shí)空 動(dòng)態(tài)，闡明這些信號(hào)蛋白間不同的時(shí)空動(dòng)態(tài)相互作用如何決定 鈣 信號(hào) 和 ROS 信號(hào) 轉(zhuǎn)導(dǎo)的特異性修飾，有重點(diǎn)地揭示關(guān)鍵蛋白行為異常與細(xì)胞鈣信號(hào)、 ROS 信號(hào)失穩(wěn)態(tài)的關(guān)系。同時(shí)，有重點(diǎn)地研究病理?xiàng)l件下，三者間失衡與細(xì)胞信號(hào)失穩(wěn)態(tài)的關(guān)系。在此復(fù)雜系統(tǒng)中，信號(hào)分子的時(shí)空活動(dòng)在微觀上看是隨機(jī)的，但整個(gè)信號(hào)系統(tǒng)卻是穩(wěn)態(tài)的，或者說具有穩(wěn)健性。作為本項(xiàng)目有特色的部分，我們將在這些定量數(shù)據(jù)的基礎(chǔ)上， 使用統(tǒng)計(jì) 力學(xué) 、微分幾何、拓?fù)浜蛢?yōu)化等數(shù)學(xué)理論 ， 建立分子寡聚體系 間相互作用的 隨機(jī)動(dòng)力學(xué)模型 。 5. 細(xì)胞動(dòng)態(tài)研究關(guān)鍵 成像 技術(shù) 我們?cè)谝陨锨把靥剿髦校瑢?duì)新模態(tài)、高分辨、高通量成像研究技術(shù)產(chǎn)生迫切需求。發(fā)展多維數(shù)據(jù)實(shí)時(shí)處理算法。