【正文】 期目標： 科學問題： 1） 鞏膜細胞外基質(zhì)合成和降解的調(diào)控機制； 2）這些調(diào)控機制調(diào)節(jié)鞏膜細胞外基質(zhì)合成和降解從而控制眼軸的生長并出現(xiàn)近視； 3）鞏膜細胞外基質(zhì)合成和降解的調(diào)控機制是否能解釋某些人類病理性近視的 發(fā)病機制。 研究內(nèi)容： 1） 、近視形成過程中，鞏膜細胞外基質(zhì)的改變及其調(diào)控機制（形覺剝奪性近視和鏡片誘導性近視動物模型的鞏膜細胞外基質(zhì)研究）； 2)、鞏膜細胞外基質(zhì)改變 導致 近視形成的 機制 3)、鞏膜成纖維細胞體外培養(yǎng)株及鞏膜組織培養(yǎng)的研究 經(jīng)費比例： 12% 承擔單位： 溫州醫(yī)學院 課題負責人： 呂帆 學術(shù)骨干： 魯新成 鹿?jié)櫹? 課題 近視發(fā)生相關(guān)視覺信息處理異常的遺傳因素研究 預期目標： 科學問題： 1）定位病理近視形成的相關(guān)基因多態(tài)位點； 2）確定遠程調(diào)控區(qū)域的靶基因和結(jié)合位點對病理近視形成的調(diào)控； 3）篩選與病理性近視并發(fā)癥相關(guān)的易感基因，并進行大規(guī)模人群隨訪，確定易感基因位點與病理性近視并發(fā)癥的相關(guān)性。同時，本課題將在個體和群體遺傳學分析、海量序列數(shù)據(jù)分析、基因組多態(tài)分析、統(tǒng)計和數(shù)據(jù)庫建立等多方面培養(yǎng)出一批掌握高級基因組研究手段的人才，為我國相關(guān)研究提供人力支持。 4） 、通過對模式生物誘導近視模型的鞏膜細胞表達譜及甲 基 化圖譜分析確定與近視形成相關(guān)的表觀遺傳學變化。 6） 、篩選與病理性近視并發(fā)癥相關(guān)的易感基因，并進行多臨床中心基地大規(guī)模人群隨訪，確定易感基因位點與病理性近視并發(fā)癥的相關(guān)性。四川省人民醫(yī)院 課題負責人： 曾長青 學術(shù)骨干： 楊正林 周翔天 吳金雨 石毅 張悅正 課題 與近視發(fā)生相關(guān)的視覺信息加工與處理異常之視網(wǎng)膜和鞏膜基因表達調(diào)控研究 預期目標： 科學問題： 篩選并闡明 非編碼 RNA、 DNA 甲基化與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機制 在近視發(fā)生發(fā)展中的作用，并進一步闡明其機制。 研究內(nèi)容： 1） 、 系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)和鑒定新的 近視 相關(guān)非編碼 RNA。 3） 、 研究新非編碼 RNA對近視相關(guān)細胞生物學性狀的影響 。 5） 、 研究新非編碼 RNA參與及影響與近視相關(guān)的細胞內(nèi)信號傳導通路。本課題擬提出的科學問題： 視覺信號處理、 傳遞 異常對眼球的病理生理改變及其在并發(fā)癥 中的作用 ，包括視網(wǎng)膜的 DA 改變，可能導致眼底并發(fā)癥的發(fā)生；是否存在導致鞏膜細胞外基質(zhì)改變的信號，逆向傳遞到視網(wǎng)膜，從而出現(xiàn)眼底并發(fā)癥？針對其信息傳遞和加工的干預，是否有可能限制并發(fā)癥的 發(fā)生或延緩并發(fā)癥的 進展 研究目標： 本課題擬利用病理性近視動物模型，探討病理性近視視網(wǎng)膜、脈絡膜的血管性異常以及鞏膜細胞外基質(zhì)的異常，以探明病理性近視最常見的并發(fā)癥脈絡膜新生血管（ CNV）以及后鞏膜葡萄腫的發(fā)病機制，探索視覺信息傳遞在鞏膜和視網(wǎng)膜病變之間交流的存在和相互間關(guān)系，研究病理性近視并發(fā)癥的發(fā)生機制，同時探討通過信息傳遞的干預達到 減少 或緩解 并發(fā)癥的可能 。 1）、 探討病理性近視動物模型 CNV 以及后鞏膜葡萄腫形成的過程與自然預后 。 3）、 探索視覺信息傳遞在鞏膜和視網(wǎng)膜病變之間交流的存在和相互間關(guān)系 。 經(jīng)費比例： 12% 承擔單位： 廈門大學 課題負責人： 劉祖國 學術(shù)骨干： 李煒 陳永雄 安建宏 各課題間相互關(guān)系 如圖 2，本項目所設置的 6 個課題相對獨立，但又互相交匯并緊密聯(lián)系。在課題一進行中，可發(fā)現(xiàn)病理性近視患者及家系，為高度近視的遺傳研究提供遺傳資源（課題三）。此外，視網(wǎng)膜和鞏膜上基因表達的改變，也可能和并發(fā)癥發(fā)生的機制相聯(lián)系（課題六）。而視網(wǎng)膜遞質(zhì)的改變，本身也可能是影響并發(fā)癥出現(xiàn)的一個因素（課題六）。 （ 5）近視的遺傳因素研究（課題四），其立論依據(jù)就是病理性近視是視覺信號傳遞處理加工過程中的相關(guān)基因的異常所致，因此篩選出的致病基因或易感基因，最后需要從基因表達（課題五）、視網(wǎng)膜 神經(jīng) 遞質(zhì)（課題二）、鞏膜細胞外基質(zhì)（課題三）等方面進一步研究其致病機制。 本項目力圖 通過凝練上述科學問題，設計 新的 研究方法和步驟， 以闡明 近視發(fā)生發(fā)展的機制，對近視發(fā)生發(fā)展機制以及相關(guān)的臨床干預機制 進行探討 。 技術(shù)路線： 根據(jù)本項目學術(shù)思路，設計 六個方向 課題 進行 深入研究 （ 如 圖 3 所示 ） ，課題將設置基因定位和易感基因篩選，模式動物和動物模型，群體和分子流行病學等研究基地或平臺。本項目從環(huán)境到遺傳，從基礎到臨床，同時又相互結(jié)合，本項目不論從科學問題的提出，還是從解決科學問題的總思路和研究方案都具有較好的創(chuàng)新性和實施的可行性。 我國是近視大國，本項目緊密結(jié)合我國該病的特點和豐富的遺傳和臨床資源，以及在某些點上已獲得的突破性進展（見國內(nèi)外研究現(xiàn)狀 和發(fā)展趨勢部分 ）和前期的預實驗結(jié)果 （見現(xiàn)有工作基礎和條件部分） ，通過繼續(xù)擴大和深入研究，吸引相關(guān)領域 的人才參與，從不同學科出發(fā)，利用不同技術(shù)，從多個角度入手，從而將對近視的研究連成一片，有望在近視研究方面獲得突破 的進展 ，課題設計具有高度可行性 。 四、年度計劃 研究內(nèi)容 預期目標 第 一 年 我國學齡期兒童近視的患病情況及 相關(guān)的 環(huán)境因素 建立形覺剝奪和鏡片誘導動物等屈光動物模型 及并發(fā)新生血管模型。明確可能引起屈光發(fā)育異常的視覺因素。 明確近視發(fā)生發(fā)展過程中鞏膜形態(tài)學改變，闡明鞏膜細胞外基質(zhì)合成和降解的動態(tài)過程及其調(diào)控機制 收集兩個大型高度近視家系和兩個大型并發(fā) CNV家系，并提取 DNA，收集 800例單純性近視 800 度的樣本和 900 例近視 50 度的對 照樣本，收集 500 例并發(fā)CNV樣本，并提取 DNA。結(jié)合局部注射多巴胺 D1 受體和 D2受體的激動劑和拮抗劑或體內(nèi)注射 RNAi干預特定受體，了解多巴胺受體亞型對屈光發(fā)育和實驗性近視的影響。 研究各種影響鞏膜細胞外基質(zhì)的變化及對屈光的影響。 建立和完善病理性近視并發(fā)癥的動物模型。 理性近視家系連鎖分析，關(guān)聯(lián)分析樣本收集 ，開始 病理性近視全基因組關(guān)聯(lián) 分析。 建立光學矯正、界面曲率改變、調(diào)節(jié)變化、藥物使用或眼保健操等干預措施的隨機對照試驗人群，闡明 光學像質(zhì)或調(diào)節(jié)與視覺信息認知的關(guān)系 建立白化病豚鼠和多巴胺 D2 受體敲除小鼠近視模型。逐步明確多巴胺 D1 和 D2 受體與近視發(fā)生發(fā)展的關(guān)系。 通過全基因組 SNP 芯片對收集到的兩個大型高度 近視家系和兩個大型并發(fā) CNV家系進行連鎖分析，確定候選區(qū)域。繼續(xù)收集 900 例單純性近視 800度的樣本和 900例近視 50度的對照樣本，收集 500 例并發(fā) CNV 樣本，并提取 DNA，開始 病理性近視全基因組關(guān)聯(lián) 分析 闡明 DNA 甲基化與組蛋白修飾等表觀遺傳調(diào)控機制對近視相關(guān)非編碼 RNA 的調(diào)節(jié)作用 建立缺氧誘導的近視眼 CNV 動物模型；闡明病理性近視發(fā)生發(fā)展過程中血管抑制因子與血管生成因子的平衡維持與破壞情況；初步闡明缺氧在病理性近視 CNV發(fā)生發(fā)展中的作用； 研究內(nèi)容 預期目標 第 三 年 學齡期兒童近視干預措施的有效性， 近視發(fā)生發(fā)展的信息調(diào)控途徑和調(diào)控機制 分析實驗性近視動物模型視網(wǎng)膜細胞內(nèi)外多巴胺的含量對近視進展的影響。利用TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠建立近視動物模型。采用病理性近視 CNV模型，在 RNA 及蛋白質(zhì)水平檢測病理性近視 CNV 以及后鞏膜葡 萄腫發(fā)生發(fā)展過程中視網(wǎng)膜以及鞏膜組織神經(jīng)遞質(zhì)多巴胺及其受體的表達情況。 病理性近視全基因組關(guān)聯(lián)分析及、重癥患者基因組功能區(qū)域測序 ，開始病理性近視候選基因 Ultra Deep Resequencin。 初步分析干預措施對防治學齡期兒童近視的效果， 驗證中樞調(diào)控機制的存在、作用強度及其與局部調(diào)控的關(guān)系 對近視動物視網(wǎng)膜多巴胺濃度以及其在細胞內(nèi)外的分布進行動態(tài)實時檢測，明確多巴胺濃 度、多巴胺在細胞內(nèi)外的分布的改變對近視進展的影響。建立TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠形覺剝奪近視模型，準備進一步進行多巴胺無長突細胞功能、形態(tài)和活動的研究。 完成各 500： 500 的高度近視全基因組關(guān)聯(lián)分析和并發(fā) CNV 關(guān)聯(lián)分析，并在各500： 500 的擴大樣本中驗證，確定導致高度近視發(fā)生和 CNV 發(fā)生的易感因素；完成 10 例高度近視重癥患者的非冗余 50X測序，分析獲得致病基因。闡明多巴胺及其受體系統(tǒng)異常與病理性近視并發(fā)癥的相關(guān)性。利用TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠近視模型，運用loosepatch clamp、全細胞膜片鉗技術(shù)以及鈣成像技術(shù)，研究形覺剝奪對多巴胺能無長突細胞自發(fā)放電、對光反應、膜電位、受體和轉(zhuǎn)運體 的影響。 建立體外培養(yǎng)鞏膜成纖維細胞細胞系和鞏膜組織培養(yǎng)。根據(jù)篩選的病理性近視的基因，制作轉(zhuǎn)基因、基因敲除或基因敲減小鼠。利用細胞培養(yǎng)方法，研究多巴胺及其受體系統(tǒng)對血管內(nèi)皮細胞增殖與凋亡、細胞遷移、管腔形成的影響 。 篩選并鑒定與近視相關(guān)非編碼 RNA 相互作用的蛋白質(zhì) 。明確近視進展過程中多巴胺能無長突細胞功能以及電活動的改變。并建立與病理性近視基因相關(guān)的轉(zhuǎn)基因、基因敲 除或基因敲減的小鼠。建立鞏膜和視網(wǎng)膜基因組遠程調(diào)控序列圖譜；著手建立人群隨訪隊列，建立病例資料和收集血液樣本。闡明多巴胺對血管內(nèi)皮細胞的細胞生物學調(diào)控作用。 利用 TH:RFP 轉(zhuǎn)基因小鼠近視模型 運用loosepatch clamp、全細胞膜片鉗技術(shù)以及鈣成像技術(shù)，研究形覺剝奪對多巴胺能無長突細胞神經(jīng)元之間信號通路、膜受體和離子通道的影響。并通過構(gòu)建定點突變或表達載體方法研究病理性近視的易感基因?qū)θ说撵柲こ衫w維細胞膠原和金屬蛋白酶合成及降解的影響。 完成病理性近視的隊列建設 。 總結(jié)、整理，補充實驗，結(jié)題 獲得我國學齡兒童近視的動態(tài)患病率和發(fā)病率及主要危險因素和保護因素，客觀準確評價近視干預措施的有效性并分析其機制 闡明視覺信號處理、傳遞加工異常在近視中的作用及其機制 ，明確形覺剝奪過程中視網(wǎng)膜多巴胺能無長突細胞與其他神經(jīng)元所形成的網(wǎng)絡連接，如神經(jīng)元間信號通路、膜受體和離子通道的改變。 在體和離體水平上闡明病理性近視基因?qū)η獾挠绊?。進一步闡明細胞外基質(zhì)在近視發(fā)生發(fā)展中的作用 建立一套高度近視易感因素基因組標記物；對 隊列樣本進行易感位點檢測，確定隊列個體疾病患病風險。 一、研究內(nèi)容 本項目將緊緊圍繞 “視覺信息加工與處理，視網(wǎng)膜到鞏膜的信號級聯(lián)和傳遞 ”這一近視形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié)和科學問題，在環(huán)境、基因及其相互作用，在眼球視網(wǎng)膜、鞏膜 乃至視覺中樞 的作用及其相互聯(lián)系，在臨床表現(xiàn)和干預等 數(shù) 個相互獨立而又密切聯(lián)系的層面上開展深入研究 。在闡明上述問題的基礎上，最終提出具有科學理論基礎的近視干預