【正文】 大 ， 可切割出較大的切片； （ 4） 刀鋒不易損傷 ， 故可用于連續(xù)切片；（ 5） 刀鋒銳利 ， 一般無(wú)刻痕 ， 可得到 10～ 20nm平整滿意的切片 。 1． 玻璃刀 制作玻璃刀所用的玻璃 ， 必須為不含雜質(zhì)的硬質(zhì)玻璃 ， 其厚度要求為 5～ 6mm。 玻璃刀制作簡(jiǎn)便 ，價(jià)格低廉 ， 但刀刃脆不耐用 ， 而且不能切割硬質(zhì)材料 。 修塊定位 ? 粗修 （可用刀片完成） ? 細(xì)修 （玻璃刀或鉆石刀完成） ? 最終形成一個(gè)小、扁平、四邊的金字塔保證上下兩條邊互相平行 四 、 切片刀 ? 切片刀的制備與選擇是超薄切片成敗的關(guān)鍵之一 。 ， 角向外粗修出四個(gè)斜面 ， 使包埋塊頂端呈錐體狀；然后在立體顯微鏡下進(jìn)行細(xì)修 ， 此時(shí)用雙面刀片將包埋塊頂端修平 ， 使其露出組織 （ 注意不要修及組織 ） 。 包埋塊頂端的四周則修成錐體狀 。 使包埋于其中的組織露于包埋塊的尖端 ， 才能用于切片 。 為了判斷碳膜的噴發(fā)厚度 ， 可在銅網(wǎng)旁邊放一小塊白瓷板作為指標(biāo)板 ， 瓷板上滴一滴真空油 ， 當(dāng)碳噴發(fā)時(shí) ， 若油滴周圍呈現(xiàn)出淡褐色 ，而油滴表面仍為透明白色 ， 則此時(shí)碳膜的厚度正好符合要求 。 取上述磨制好的碳棒裝在真空噴鍍儀的電極柱上 ， 使推進(jìn)極的尖端與固定極的平端相接觸 ， 并調(diào)整碳極噴發(fā)點(diǎn)至樣品的距離 12～ 14cm。 3． 碳膜的機(jī)械強(qiáng)度和化學(xué)穩(wěn)定性能均優(yōu)于其它支持膜 ， 因此多用來(lái)觀察高分辨樣品 。 制膜時(shí)先取直徑 9～ 12cm的培養(yǎng)皿 ， 盛滿雙重蒸餾水 ， 在水面上輕輕滴 1～ 2滴上述溶液 ， 醋酸異戊酯很快揮發(fā)后 ， 即可在水面上形成一層均勻的火棉膠薄膜 。 2． 火棉膠膜 常用 1～ 2％ 火棉膠醋酸異戊酯溶液 。 制膜時(shí)玻璃片一定要光潔干凈 ， 否則 Formvar膜不能從玻片上脫落飄起；制膜時(shí)室內(nèi)濕度不能太大 （ ＜ 60％ ） ， 否則易在膜上出現(xiàn)微孔；另外 ， 溶劑中不能混有水分與雜質(zhì) ， 操作時(shí)應(yīng)注意防止 ， 否則膜上會(huì)有許多斑點(diǎn) 。 首先制備 %的氯仿 （ 或二氯乙烯 ） 溶液 ， 然后用洗凈的玻璃片伸入到該溶液中停留片刻 ， 平穩(wěn)取出 ，自然干燥后玻片上形成一層薄膜 ， 再用刀片沿玻片邊緣將膜劃破 ，繼將該玻片的一端浸入玻璃平皿的蒸餾水中 ， 待玻片上的薄膜完全漂在水面 ， 把玻片輕輕下壓取出 。 用做支持膜的原料有 Formvar、 火棉膠和噴碳等 。 二 、 制備支持膜 取清洗干凈的銅網(wǎng) ， 向它的表面制備一層透明而無(wú)結(jié)構(gòu)的支持膜 ， 以便承載有關(guān)的切片樣品 。 ? （ 2） 超聲清洗法：先將舊銅網(wǎng)放入小燒杯內(nèi) ， 以醋酸異戊酯或二氯乙烷溶去火棉膠膜和 Formavar膜 ， 浸泡時(shí)間約半小時(shí) 。 倒出硫酸 ，水洗數(shù)次后 ， 再用氨水清洗一次 ， 用蒸餾水反復(fù)洗滌數(shù)次 。 清洗的目的是去除銅網(wǎng)上的油污 ， 以便支持膜與銅網(wǎng)得以牢固的貼附 。 因此如果觀察分辨率要求高的樣品時(shí) ， 則選用 200目以上的銅網(wǎng) ， 以增強(qiáng)樣品的穩(wěn)定性能 。 銅網(wǎng)大都以電解法制成 ， 直徑 3mm（ 少數(shù)為 2mm） ， 網(wǎng)孔的形狀有園形 、 方形 、 單孔形 、 狹縫形等 ， 網(wǎng)孔的數(shù)目有50～ 400目多種規(guī)格 。 當(dāng)進(jìn)行超薄切片前 ， 必須做好一切準(zhǔn)備工作 ， 如制備支持膜 、 制備玻璃刀 、 修整包埋塊等 ， 開始切片時(shí)必須心境平穩(wěn) ， 精力集中 ， 避免任何干擾 （ 如隨意離位 、各種振動(dòng) 、 人員往來(lái) 、 塵粒污染等 ） 。 第六節(jié) 超薄切片 超薄切片是將固化的包埋塊在超薄切片機(jī)上切為薄片的過(guò)程 （ 厚度約為 50nm） ， 它是整個(gè)制樣程序的中心環(huán)節(jié) 。 ? 操作時(shí)皮膚切勿接觸包埋劑 ， 以防引起皮炎 ， 有的包埋劑有致癌作用 ， 應(yīng)注意防護(hù) 。 但從冰箱中取出的藥品必須等到恢復(fù)至室溫時(shí)才允許打開蓋子 ， 否則水分會(huì)進(jìn)入藥品內(nèi) 。 清洗時(shí)先用廢紙擦凈剩余的包埋劑 ， 而后再用丙酮洗凈 。如直接以 60℃ 恒溫箱加溫聚合48小時(shí)亦可。然后將上述包埋板放入恒溫箱內(nèi)加溫聚合。 包埋 常規(guī)包埋法：一般包埋可在藥用膠囊或特制的錐形薄塑料管內(nèi)進(jìn)行 ， 近些年來(lái)大都采用特制的多孔 （ 錐形 ）橡膠或硅膠包埋板 。 ? 浸透的具體過(guò)程為：脫水后樣品迅速移入丙酮 、 包埋劑等量混合液 ， 30分鐘或數(shù)小時(shí) 。 如乙二醇甲基丙烯酸脂 （ 簡(jiǎn)稱GMA） 、 K4M等 。 ? 配方： A液 Epon812 10ml B液 Epon812 10ml DDSA 16ml MNA 水溶性包埋劑：是進(jìn)行細(xì)胞化學(xué)研究較理想的包埋劑 ， 由于這種包埋劑呈水溶性 ， 所以組織標(biāo)本可以在水洗后直接投入包埋劑中 ， 避免因使用乙醇 、 丙酮等脫水劑對(duì)樣品成分的抽提 ， 同時(shí)也避免組織內(nèi)酶活性的降低 、 破壞和人為擴(kuò)散 。 ? 增塑劑（不是必需的） 鄰苯二甲酸二丁酯（簡(jiǎn)稱DBP）．其主要作用是提高包埋塊的彈性和韌性，改善其切割性能。 包埋塊切片時(shí)的難易 ， 與樹脂 、 固化劑 、 增塑劑及催化劑之間的比例有關(guān) ， 而且還取決于聚合的溫度 、 時(shí)間等因素 。 它具有三維交聯(lián)結(jié)構(gòu) ，包埋后可保存細(xì)胞內(nèi)的微細(xì)結(jié)構(gòu) ， 對(duì)組織損傷小 ， 聚合后體積收縮率低 （ 僅有 2％ 左右 ） ， 耐受電子束轟擊性能好 。 能耐受電于束的照射與轟擊； ④ 在浸透包埋過(guò)程中 ，對(duì)細(xì)胞成分抽提少 ， 可保存其微細(xì)結(jié)構(gòu)； ⑤ 在電鏡高倍放大下 ， 不顯示包埋劑本身的任何微細(xì)結(jié)構(gòu)； ⑥ 包埋后具有良好的切片性能 ， 包括均勻性 、 可塑性 ， 硬度和彈性等； ⑦ 對(duì)人體無(wú)毒害作用 ， 且材料來(lái)源豐富 ， 操作簡(jiǎn)便 ， 價(jià)格便宜 。 ? 為了確保浸透與包埋的質(zhì)量 ， 選擇好適當(dāng)?shù)陌駝┦鞘直匾?。包埋塊的硬度和彈性應(yīng)該適中 ， 而且其中不能夾有氣泡 ， 否則切片易于變形 ， 很難得到理想的切片 。 第五節(jié) 浸透與包埋 、 包埋的目的要求 ? 經(jīng)過(guò)脫水處理后的樣品 ， 即可用包埋劑進(jìn)行浸透 ， 其目的是用包埋劑逐步取代樣品中的脫水劑 ， 使細(xì)胞內(nèi)外所有空隙都被包埋劑所填充 。 3． 脫水操作時(shí) ， 動(dòng)作要盡量迅速 ， 特別是 100％ 脫水劑時(shí) ， 更要注意樣品塊不要在空氣中停留時(shí)間過(guò)長(zhǎng) ， 否則會(huì)造成樣品干燥 ，使樣品內(nèi)產(chǎn)生小氣泡致使包埋劑難以浸透 。 2． 如果當(dāng)天完不成浸透 、 包埋操作時(shí) ， 應(yīng)將樣品停留在 4℃ 70％脫水劑中保存過(guò)夜 ， 因?yàn)橐话阏J(rèn)為 70％ 的濃度時(shí)所引起的組織塊體積變化最小 。 ? 游離和培養(yǎng)細(xì)胞的脫水時(shí)間可適當(dāng)縮短 。 因此 ，要求脫水時(shí)必須逐級(jí)提高有機(jī)溶劑的濃度 ， 而且每一級(jí)脫水的時(shí)間不應(yīng)過(guò)長(zhǎng) ， 一般以 10～ 15分鐘為宜 。 它們是既能與水相混溶 ， 又能與包埋劑相混溶的有機(jī)溶劑 。 如果含有水分的生物樣品進(jìn)入電鏡的高真空中，樣品就會(huì)急驟收縮并放出水蒸氣，這樣就會(huì)使電鏡的高真空遭到損壞，并且造成鏡筒的污染。 脫水是指將組織內(nèi)所含的游離水完全清除的過(guò)程，屬于包埋前必經(jīng)步驟。植物或骨組織需要較長(zhǎng)時(shí)間漂洗。 第四節(jié) 漂洗與脫水 前后固定之間的漂洗，固定后脫水前的漂洗。由于組織樣品是由表及里逐層固定的，存在著固定的梯度，所以樣品的大小，直接關(guān)系到固定的均勻性 .“ 小”的樣品是實(shí)現(xiàn)均勻固定的最重要的條件。 4． 固定的時(shí)間 、 溫度和樣品塊的大小 在任何情況下不管使用何種固定劑，都應(yīng)在溫度較低的情況下進(jìn)行。 戊二醛常用濃度為 1％ 6％ ， 鋨酸 1％ 2％ 。 過(guò)高的濃度易毀壞酶的活性及細(xì)胞的精細(xì)結(jié)構(gòu) 。 固定液中加有兩價(jià)陽(yáng)離子，可以減少細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)的抽提。在固定液內(nèi)加入適量的非電解質(zhì)或電解質(zhì)類物質(zhì)，調(diào)節(jié)其滲透壓，使之成為等滲溶液。 動(dòng)物組織適用 右的固定液 ， 植物細(xì)胞以 ～ 。 1． 固定液的酸堿度 （ pH值 ） 固定液的酸堿度必須與被固定組織的酸堿度基本一致 。缺點(diǎn)是有臭味、有毒性，應(yīng)在通風(fēng)柜中配制。 （ 2）二甲砷酸鹽緩沖液 () 儲(chǔ)備液 甲液：二甲砷酸鈉 蒸餾水加至 100ml 乙液： pH 7 甲液 (ml) 50 50 50 50 50 50 乙液 (ml) 不同 pH值二甲砷酸鈉緩沖液的配制 按表 8－ 2混合甲、乙液后，再加蒸餾水成 200ml，即可得到不同 pH的緩沖液。2H 2O ) 加蒸餾水溶解成 1000ml 工作液：混合甲、乙二液，即可得到 50ml所需 pH值的緩沖液。12H 2O ) 加蒸餾水溶解成 1000ml 乙液 Na H2PO4 （ 1）磷酸鹽緩沖液 () 儲(chǔ)備液：甲液 Na2 HPO4盡量不與皮膚直接接觸，避免呼吸道吸入。常用于配置戊二醛固定液和多聚甲醛固定液，并適于灌流固定。 （三）常用的緩沖液 ? 磷酸鹽緩沖液 仿效細(xì)胞外液成分配成，優(yōu)點(diǎn)是便宜，無(wú)毒性作用；缺點(diǎn)是久放易產(chǎn)生沉淀并易遭到細(xì)菌的污染。易分解，在冰箱中也極不穩(wěn)定，其滲透速度比鋨酸還要慢，因此只在樣品需要時(shí)使用。因此，鋨酸溶液最好在使用前配制 . 與鋨酸性質(zhì)相近，對(duì)細(xì)胞膜、核膜及胞質(zhì)膜結(jié)構(gòu)固定效果極佳。存放鋨酸溶液的容器不干凈，或配制時(shí)間過(guò)久，鋨酸就會(huì)被氧化還原為黑色的 OSO深褐色的 OSO4 四氧化鋨還可與乙醇或醛類等發(fā)生氧化還原反應(yīng)而產(chǎn)生沉淀 ， 故用四氧化鋨固定后的樣品 ， 必須用緩沖液或雙蒸水徹底清洗后 ， 才能進(jìn)入乙醇溶液中脫水 。 四氧化鋨還是酶的鈍化劑 ， 因而不適于作細(xì)胞化學(xué)的固定 。 缺點(diǎn)：四氧化鋨對(duì)糖類和天然 DNA、 RNA保存作用極差 ， 因此單獨(dú)用四氧化鋨固定時(shí) ， 大部分碳水化合物包括糖原皆可被溶掉 。 當(dāng)經(jīng) OSO4固定后 ， 金屬鋨可被結(jié)合在細(xì)胞結(jié)構(gòu)里 ， 因而在電鏡觀察時(shí)可以獲得很好的圖像反差 ， 起到電子染色的輔助作用 。 優(yōu)點(diǎn)：能與不飽和脂肪酸反應(yīng) ， 使脂肪酸得以固定 ， 所以也是唯一能保存脂類的固定劑 。 戊二醛的配制 戊二醛最終濃度 (%) 1 2 3 4 5 (ml) 50 50 50 50 50 50 50 市售 25%戊二醛 (ml) 4 6 8 10 12 16 20 加雙蒸水至 (ml) 100 100 100 100 100 100 100 2． 四氧化鋨 （ OSO4， 鋨酸 ） 四氧化鋨是一種淡黃色 、 具有強(qiáng)烈刺激味的晶體 ， 它的水溶液呈中性 ， 故 “ 鋨酸 ” 二字實(shí)為一種誤稱 。 （ 4） .高錳酸鉀 一種強(qiáng)氧化劑 ,主要用于保存細(xì)胞的膜性結(jié)構(gòu)，對(duì)質(zhì)膜、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)及髓鞘等結(jié)構(gòu)保存良好，其他結(jié)構(gòu)則保存很差。但不能較好的固定細(xì)胞基質(zhì)，脫水后大部分細(xì)胞基質(zhì)將丟失。電鏡樣品固定多用純化的多聚甲醛，為白色粉末。丙烯醛易燃，是危險(xiǎn)化學(xué)品，可由呼吸系統(tǒng)吸入，或通過(guò)皮膚吸收，并對(duì)皮膚有強(qiáng)烈刺激作用。 （ 2） .丙烯醛 其滲透和反應(yīng)速度均較快，稍大一些組織可用丙烯醛作固定液。濃度大于 50％時(shí)在室溫下容易聚合成膠狀，低于 4％的溶液較為穩(wěn)妥。 PH為 5時(shí)在 4℃ 或更低溫度可保持穩(wěn)定狀態(tài)幾個(gè)月。 為充分發(fā)揮戊二醛固定效果，使用和儲(chǔ)存過(guò)程中應(yīng)注意： ? pH和溫度 中性或堿性均能使戊二醛聚合，失去醛基。 商品多為 25％ 的戊二醛水溶液 . ? 戊二醛作為生物樣品的固定劑 ， 具有以下優(yōu)點(diǎn)： ① 對(duì)組織的滲透力比鋨酸大 ， 而且能保存組織內(nèi)某些酶活性； ② 與蛋白質(zhì)之間的反應(yīng)較快 ， 能較好地保存蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)； ③對(duì)細(xì)胞內(nèi)的微管及滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 、 線粒體等膜性結(jié)構(gòu)保存較好； ④ 可以較好地固定和保存組織里的糖原 ， 用大白鼠的肝臟可證明大約 有 65％ 的糖原可被戊二醛保存下來(lái)； ⑤ 能夠較好的固定植物組織 。它作為超薄切片術(shù)的固定劑是從 1963年開始的 ， 至今已得到廣泛使用 。 此類固定劑的特點(diǎn)是對(duì)樣品的穿透力較強(qiáng) ， 能固定較大的組織塊 ，既能很好地固定蛋白質(zhì)和糖元等結(jié)構(gòu) ， 也不易使酶丟失活性 ，且長(zhǎng)時(shí)間固定不會(huì)使組織變脆 ， 因此能較好的保存組織的超微結(jié)構(gòu) 。 適用于解剖關(guān)系比較復(fù)雜的組織器官 （ 如垂體 、脊髓 、 甲狀旁腺等 ） 。 將固定液注入特制的帶有針頭與皮管的容器中 ， 而后選擇到達(dá)要取材器官的最短循環(huán)途徑 ， 將固定液灌注到動(dòng)物的相應(yīng)部位 。適用于較軟的組織（如腦、眼球等）。將動(dòng)物麻醉后暴露出所需器官的表面，剝開包膜，將冷的固定液滴加到被取器官上，直至組織達(dá)到適當(dāng)?shù)挠捕?。適用于各種實(shí)質(zhì)性器官，如心、肝、腎、肌肉等。組織塊