【正文】 2021rpm 離心 5 分鐘，備用 試劑準(zhǔn)備（試劑準(zhǔn)備區(qū)）直接使用 HBVPCR 反應(yīng)管 （樣品制備區(qū)） 往上述 HBV 反應(yīng)管中用帶濾芯吸嘴分別加入待測樣本、 陰性質(zhì)控品、 HBV 強(qiáng)陽性質(zhì)控品、 HBV 臨界陽性質(zhì)控品和陽性定量參考品的上清液各 20μ l。 1）取 200μ l 樣品，加入 450μ lDNA提取液 I 和 4μ l 的內(nèi)標(biāo)溶液，用振蕩器劇烈混勻 15 秒，瞬時離心數(shù)秒。 五、參考文獻(xiàn)： 1.《中國生物制品規(guī)程》（ 2021 年版），化學(xué)工業(yè)出版社 — 10— 第三篇：乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒 (PCR 熒光探針法 ) 乙型肝炎病毒核酸定量檢測試劑盒 樣本要求 ：血清或血漿 1）血清：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血 2 毫升，注入無菌的干燥玻璃管，室溫放置 30— 60min，血標(biāo)本可自發(fā)完全凝集析出血清，或直接使用水平離心機(jī)， 1500rpm 離心 5 分鐘，吸取上層血清，轉(zhuǎn)移至 滅菌離心管 2）血漿：用一次性無菌注射器抽取受檢者靜脈血 2 毫升，注入含EDTA2K 或枸櫞酸鈉的玻璃管，立即顛倒玻璃管混合 5— 10 次，使抗凝劑和靜脈血充分混勻， 5— 10 分鐘后即可分離血漿，轉(zhuǎn)移至 滅菌離心管 ：所采集的標(biāo)本可立即用于測試，也可以保存在 — 20℃待測，保存期為 6 個月，標(biāo)本運(yùn)送采用 0℃冰壺。 （ 2）穩(wěn)定性試驗(yàn) 在批放行前，每一批試劑應(yīng)完成 37℃熱穩(wěn)定性試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果應(yīng)符合產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 （ 1）成品檢驗(yàn) 成品檢驗(yàn)時，一般使用國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品）或經(jīng)國家標(biāo)準(zhǔn)品 （參考品）標(biāo)化后的企業(yè)參考品，并達(dá)到相應(yīng)質(zhì)量要求。質(zhì)檢人員同時應(yīng)檢查相關(guān)原始記錄。 產(chǎn)品包裝完成后，質(zhì)檢人員根據(jù)試劑的批號、實(shí)際包裝量、抽樣申請單的要求進(jìn)行抽樣，同時填寫抽樣數(shù)量和抽樣日期，并且由抽樣人簽名。 企業(yè)應(yīng)該對每一批試劑的半成品進(jìn)行穩(wěn)定性研究。對于精密性，一般情況下CV 不得高于 15％（采用競爭抑制法的診斷試劑 CV 不得高于 20％）。若某類試劑沒有國家標(biāo)準(zhǔn)品（參考品），則使用企業(yè) 參考品，企業(yè)參考品的制備應(yīng)有規(guī)范的質(zhì)量控制程序，以保證產(chǎn)品的安全性、有效性及質(zhì)量可控，其質(zhì)量應(yīng)不低于國家食品藥品監(jiān)督管理局已經(jīng)批準(zhǔn)的同類產(chǎn)品的質(zhì)量。 （ 2）半成品檢驗(yàn) 根據(jù)試劑盒的企業(yè)標(biāo)準(zhǔn)或者制檢規(guī)程進(jìn)行半成品的檢驗(yàn)。包裝前，應(yīng)嚴(yán)格檢查試劑盒的品名、批號等，核對各試劑盒各組分的數(shù)量，并在關(guān)盒前進(jìn)行復(fù)核。 樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等溶液應(yīng)嚴(yán)格按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的量進(jìn)行過濾后再分裝，分裝量的誤差應(yīng)小于 5%。 選擇經(jīng)檢驗(yàn)合格的包被原料（如抗原、抗體等），經(jīng)一定的方法確定最佳包被濃度和酶結(jié)合物工作濃度，按照診斷試劑的生產(chǎn)規(guī)程，配制包 被緩沖液、封閉液，經(jīng)檢驗(yàn)合格后，包被酶標(biāo)反應(yīng)板，經(jīng)干燥后，已包被的酶標(biāo)反應(yīng)板用鋁箔紙封閉（內(nèi)臵干燥劑），保存于 2 8℃。酶標(biāo)反應(yīng)板經(jīng)檢驗(yàn)合格后方能用于包被。 應(yīng)對配制過程及配制的液體進(jìn)行的質(zhì)量控制，主要包括酶結(jié)合物的 — 7— 功能性實(shí)驗(yàn)及穩(wěn)定性；各種溶液的外觀、 pH 值等；酶作用底物應(yīng)測定在無相應(yīng)酶的情況下自身顯色的情況，并制定合理的限定指標(biāo)；終止液應(yīng)對其終止酶促反應(yīng)的能力進(jìn)行測定。 各種工作液在配制過程中應(yīng)嚴(yán)格按質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中的配方進(jìn)行配制，充分混勻確保液體中的各種成分均勻，同時進(jìn)行相應(yīng)的質(zhì)量檢驗(yàn)并達(dá)到質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)后，方可使用或分裝。 酶聯(lián)免疫診斷試劑研制生產(chǎn)過程中所用的工作液一般包括：包被液、封閉液、陰性陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液 、終止液等，對定量檢測試劑，還包括標(biāo)準(zhǔn)品（或校準(zhǔn)品）溶液。 企業(yè)質(zhì)控品的基質(zhì)應(yīng) 與診斷試劑的待測樣品的基質(zhì)基本一致，如待測樣品為血清 /血漿，質(zhì)控品基質(zhì)也應(yīng)為血清 /血漿。 — 6— 企業(yè)質(zhì)控品一般包括陰 /陽性參考品的符合率、靈敏度（最低檢出量）、精密性、鉤狀效應(yīng)（ hook 效應(yīng)）等質(zhì)控樣品，對于定量檢測試劑，還包括線性質(zhì)控品樣品。 （ 2）液體試劑裝量瓶 包括陰陽性對照、樣品稀釋液、洗滌液、酶結(jié)合物或酶稀釋液、底物或底物緩沖液等液體組分，均應(yīng)有相應(yīng)的裝量瓶，并建立相應(yīng)的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)，如不同的液體試劑所用的裝量瓶規(guī)格、裝量瓶的顏色、瓶蓋的顏色等。 一般用一定濃度的正常人免疫球蛋白 G(IgG)包被板條，再用一定濃度的抗人 IgG 酶結(jié)合物吸附，通過顯色反應(yīng)，使用酶標(biāo)儀讀數(shù)，計算 CV 值。 （ 1）酶標(biāo)板①外觀 明亮處用肉眼觀察板條的外觀質(zhì)量，如有欠注、飛邊、骯臟、表面光潔度差，底部有波紋及劃傷等應(yīng)剔除。 主要化學(xué)原材料的供應(yīng)商要求相對固定，不得隨意發(fā)生變更。 生物輔料的供應(yīng)商同樣要求相對固定，不得隨意變更供應(yīng)商。（ 4）標(biāo)記用酶 應(yīng)在產(chǎn)品的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)中明示所使用的標(biāo)記用酶的名稱（如辣根過氧化物酶、堿性磷酸酶等），同時應(yīng)根據(jù)不同生產(chǎn)廠家的 檢驗(yàn)方法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢驗(yàn)，酶的純度 RZ 值（ OD403nm/OD280nm）應(yīng)大于 。 BSA 的凈含量：總蛋白含量乘總蛋白中的 BSA 含量，其標(biāo)準(zhǔn)為≥90%。 總蛋白含量：用雙縮脲法，其標(biāo)準(zhǔn)為≥ 95％。 （ 2）牛血清白蛋白： 外觀：應(yīng)為淺黃色、黃色或乳白色的凍干粉末，無吸潮，無結(jié)塊，無肉眼可見的其它雜質(zhì)顆粒。 總蛋白含量：用雙縮脲法測定，蛋白含量≥ 32mg/ml。建議作以下檢驗(yàn)： （ 1）牛血清或羊血清 外觀：為淺黃色澄清稍粘稠的液體，無溶血或異物。 生物輔料一般指在生產(chǎn)過程中作為蛋白保護(hù)劑用途的一類生物原料，主要包括小牛血清、山羊血清、牛血清白蛋白和酪蛋白等。效價應(yīng)達(dá)到規(guī)定的要求。 （ 3）蛋白濃度 蛋白濃度可通過 Lowry 法、 280nm 光吸收法、雙縮脲法或其他適宜的方法進(jìn)行檢測。根據(jù)所檢測生物原料的分子量選擇適宜聚丙烯酰胺凝膠濃度進(jìn)行電泳，一般每個電泳道加樣量為 5μ g，電泳后的凝膠可用考馬斯亮藍(lán)染色或銀染法染色。 主要生物原料的常規(guī)檢驗(yàn)項(xiàng)目一般包括：（ 1）外觀 肉眼觀察，大部分生物原料為澄清均一的液體，不含異物、渾濁或搖不散的沉淀或顆粒；或者為白色粉末，不含其他顏色的雜質(zhì)；特殊生 — 3— 物原料應(yīng)具備相應(yīng)外觀標(biāo)準(zhǔn)。使用前應(yīng)按照工藝要求對這類生物原料進(jìn)行質(zhì)量檢驗(yàn)，以保證其達(dá)到規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。 （二）原材料質(zhì)量控制 與產(chǎn)品質(zhì)量最密切相關(guān)的生物原料主要包括各種天然抗原、重組抗原、單克隆抗體、多克隆抗體以及多肽類、激素類等生物原科。 、生產(chǎn)過程中所用的各種材料及工藝，應(yīng)充分考慮可能涉及的安全性方面的事宜。企業(yè)應(yīng)對試劑的使用范圍做出明確規(guī)定，并經(jīng)國家藥品監(jiān)督管理部門批準(zhǔn)。 三、基本要求 （一）基本原則 、生產(chǎn)用的各種原料、輔料等應(yīng)制定其相應(yīng)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，并應(yīng)符合有關(guān)法規(guī)的要求。 二、適用范圍 本指導(dǎo)原則適用于有關(guān)病原微生物檢測的第三類體外診斷試劑的注冊技術(shù)審查。應(yīng)在遵循相關(guān)法規(guī)的前提下使用本指導(dǎo)原則。 本指導(dǎo)原則系對酶聯(lián)免疫法檢測試劑的一般要求，申請人應(yīng)依據(jù)產(chǎn)品特性確定其中的具體內(nèi)容是否適用，若不適用，需詳細(xì)闡述其理由及相應(yīng)的科學(xué)依據(jù)。 三、參考文獻(xiàn) 1.《體外診斷試劑注冊管理辦法》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局令第 5 號）， 2021 年 7 月 .《體外診斷試劑臨床試驗(yàn)技術(shù)指導(dǎo)原則》，（國家食品藥品監(jiān)督管理總局公告 2021 年第 16 號），2021 年 9 月 11 日 .3.《體外診斷試劑說明書編寫指導(dǎo)原則》，（國家食品藥品監(jiān) 督管理總局公告 2021 年第 17 號）， 2021 年 9 月 11 日 .食品藥品監(jiān)督管理總局關(guān)于公布體外診斷試劑注冊申報資料要求和批準(zhǔn)證明文件格式的公告（國家食品藥品監(jiān)管總局公告 2021年第 44號），2021年 9月 5日 .，中華醫(yī)學(xué)會感染病學(xué)分會 .慢性乙型肝炎防治指南（ 2021 年版） .實(shí)用肝 XVI 臟病雜志，第 19 卷第 3 期 2021 年 5 月： .病毒性肝炎臨床實(shí)踐，人民衛(wèi)生 出 版 社 ，icalPracticeGuidelinesonthemanagementofhepatitisBvirusinfect， 67： ， ， Diagnosis ，andTreatmentofChronicHepatitisB ： ， 2021 ， 67 （ 4 ）：“ e”antigenandantibodytoHepatitisB “ e ”、起草單位國家藥品監(jiān)督管理局醫(yī)療器械技術(shù)審評中心。 不合理的樣本采集、轉(zhuǎn)運(yùn)及處理以及不當(dāng)?shù)膶?shí)驗(yàn)操作和實(shí)驗(yàn)環(huán)境均有可能導(dǎo)致假陰性或假陽性結(jié)果。如有適用的臨床診療指南，則應(yīng)在此項(xiàng)下引用，相應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果的解釋應(yīng)符合相關(guān)指南的要求。 （質(zhì)控品）以及樣本的檢測結(jié)果，對所有可能出現(xiàn)的結(jié)果組合及相應(yīng)的解釋進(jìn)行詳述。 診療規(guī)范、防治指南、專家共識，其臨床試驗(yàn)入組病例應(yīng)能夠覆蓋產(chǎn)品適用人群。產(chǎn)品說明書中相關(guān)技術(shù)內(nèi)容均應(yīng)與申請人提交的注冊申報資料中的相關(guān)研究結(jié)果保持一致，如某些內(nèi)容引用自參考文獻(xiàn)，則應(yīng)以規(guī)范格式對此內(nèi)容進(jìn)行標(biāo)注，并單獨(dú)列明文獻(xiàn)的相關(guān)信息。 （十）產(chǎn)品說明書說明書承載了產(chǎn)品預(yù)期用途、樣本采集及處理、檢驗(yàn)方法、檢驗(yàn)結(jié)果的解釋以及注意事項(xiàng)等重要信息，是指導(dǎo)實(shí)驗(yàn)室工作人員正確操作、臨床醫(yī)生針對檢驗(yàn)結(jié)果給出合理醫(yī)學(xué)解釋的重要依據(jù)，因此，產(chǎn)品說明書是體外診斷試劑注冊申報最重要的文件之一。 （九 ）產(chǎn)品檢驗(yàn)報告根據(jù)《辦法》的要求，首次申請注冊的第三類體外診斷試劑產(chǎn)品應(yīng)在具有相應(yīng)醫(yī)療器械檢驗(yàn)資質(zhì)和承檢范圍的醫(yī)療器械檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)進(jìn)行連續(xù) 3 個生產(chǎn)批次樣品的產(chǎn)品檢驗(yàn)。申報試劑已有適用的國家標(biāo)準(zhǔn)品、參考品發(fā)布，申請人應(yīng)在產(chǎn)品技術(shù)要求中提出檢測要求。 （八）產(chǎn)品技術(shù)要求申請人應(yīng)當(dāng)在原材料質(zhì)量和生產(chǎn)工藝穩(wěn)定的前提下，根據(jù)申請人產(chǎn)品研制、臨床評價等結(jié)果，依據(jù)國家標(biāo)準(zhǔn)、行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)及有關(guān)文獻(xiàn)，按照《醫(yī)療器械產(chǎn)品技 術(shù)要求編寫指導(dǎo)原則》（國家食品藥品監(jiān)督管理總局通告 2021 年第 9 號）的有關(guān)要求，編寫產(chǎn)品技術(shù)要求。 作為臨床評價資料時，其境外臨床試驗(yàn)資料在滿足《接受醫(yī)療器械境外臨床試驗(yàn)數(shù)據(jù)技術(shù)指導(dǎo)原則》要求的基礎(chǔ)上，應(yīng)至少有一家臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)在中國境內(nèi)，檢測病例數(shù)不低于總病例數(shù)的 1/3。 ，建議進(jìn)行臨床試驗(yàn)的預(yù)試驗(yàn)，以熟悉并掌握相關(guān)試驗(yàn)方法的操作、儀器、技術(shù)性能等，最大限度控制試驗(yàn)誤差。 ，必須獲得臨床試驗(yàn)機(jī)構(gòu)倫理委員會的同意。除此之外，還應(yīng)同時進(jìn)行假設(shè)檢驗(yàn)評價兩種分析方法的一致性。 臨床試驗(yàn)樣本量除需滿足上述統(tǒng)計學(xué)估算的最低樣本量要求外，還應(yīng)保證入組病例覆蓋受試者的各種特征； 如臨床試驗(yàn)研究有更合理的樣本量估算方式，在說明其合理性后亦可采用。 如申報產(chǎn)品性能顯著優(yōu)于已上市同類產(chǎn)品，可將試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床參考標(biāo)準(zhǔn)的比較研究和試驗(yàn)用體外診斷試劑與境內(nèi)已上市同類產(chǎn)品的比較研究相結(jié)合，進(jìn)行臨床研究，可采用優(yōu)效性試驗(yàn)樣本量估算的方法估算樣本量。 HBeAg、抗 HBe 檢測試劑為定性檢測產(chǎn)品，如臨床試驗(yàn)采用申報產(chǎn)品與已上市同類產(chǎn)品進(jìn)行比對的試驗(yàn)設(shè)計，可采用單組目標(biāo)值法樣本量公式估算最低樣本量。臨床試驗(yàn)樣本量應(yīng)滿足統(tǒng)計學(xué)要求，可采用適當(dāng)?shù)慕y(tǒng)計學(xué)方法進(jìn)行估算。如試驗(yàn)用體外診斷試劑與臨床參考方法進(jìn)行對比研究，其臨床評價標(biāo)準(zhǔn)應(yīng)包括臨床靈敏度、臨床特異度等。申辦者應(yīng)根據(jù)產(chǎn)品特點(diǎn)及其預(yù)期用途，綜合不同地區(qū)乙型肝炎病毒流行情況等因素選擇具有代表性的機(jī)構(gòu)開展臨床試驗(yàn)，包括受試人群的代表性等。 建議臨床試驗(yàn)采用前瞻性收集的樣本進(jìn)行研究，同時，在嚴(yán)格控制偏倚的前提下，允許入組部分符合要求的既往留存樣本。 臨床試驗(yàn)中所涉及的樣本類型應(yīng)為實(shí)際臨床檢測中常用的樣本類型。入組人群還應(yīng)包括急性及慢性病毒性乙型肝炎患者，同時根據(jù)臨床驗(yàn)證需要，入組病例應(yīng)包括不同疾病進(jìn)展期（如：免疫耐受期、免疫活動期等）的患者。 試劑的預(yù)期用途、目標(biāo)人群和檢測要求等合理確定臨床試驗(yàn)受試者的選 擇要求和樣本收集方法，包括：受試者入組 /排除標(biāo)準(zhǔn)、樣本收集的前瞻性和回顧性設(shè)計等。臨床參考標(biāo)準(zhǔn)是指現(xiàn)有條件下臨床上可獲得的能夠用來確定受試者目標(biāo)狀態(tài)的