【正文】 度（ Km’增加）。要達(dá)到同一個(gè)給定的 Vmax分?jǐn)?shù)，必須要有比無(wú)抑制劑時(shí)大得多的底物濃度。 E+S→ ES+I ≠ P （三） 可逆抑制作用的動(dòng)力學(xué) 用書上 P263266 的方法可推出三種抑制方程。 非競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑多是與酶活性中心之外的巰基可逆結(jié)合，包括某些含金屬離子的化合物（ Cu2+、Hg2+、 Ag+）和 EDTA。 酶可以同時(shí)與底物及抑制劑結(jié)合，但是，中間產(chǎn)物 ESI 不能進(jìn)一步分解為產(chǎn)物，因此，酶的活性降低。 如果動(dòng)物體內(nèi)含有大量的對(duì)氨基苯磺酰胺，可與對(duì)氨基苯甲酸競(jìng)爭(zhēng)二氫葉酸合成酶的活性中心，抑制細(xì)菌二氫葉酸合成。 磺胺類藥物是對(duì)氨基苯磺酰胺或其衍生物，它是對(duì)氨基苯甲酸的結(jié)構(gòu)類似物，競(jìng)爭(zhēng)性抑制二氫葉酸合成酶 P261 結(jié)構(gòu)式：對(duì)氨基苯甲酸 對(duì)氨基苯磺酰胺 葉酸 磺胺類藥物的藥理（對(duì)氨基苯磺酰胺）： 嘌呤核苷酸的合成必需要由四氫葉酸（輔酶）提供一碳單位；四氫葉酸可由二氫葉酸或葉酸轉(zhuǎn) ２２ 化而成；二氫葉酸是在二氫葉酸合成酶作用下，利用蝶呤、對(duì)氨基苯甲酸及 Glu合成?？梢酝ㄟ^(guò)增加底物濃度而解除此種抑制。 競(jìng)爭(zhēng)性抑制（ Competitive inhibition） 抑制劑與底物競(jìng)爭(zhēng)酶的活性中心。 Kcat 型專一性不可逆抑制劑的專一性很強(qiáng)，近來(lái)已設(shè)計(jì)出多種酶的 Kcat 逆制劑，在醫(yī)療方面起到很大作用。 迫降靈是一種單胺氧化酶的自殺性底物，是治療高血壓的良藥。 舉例 1： β 羥基癸酰硫酯脫水酶的 Kcat型不可逆抑制劑： CH3(CH2)5C=CCH2COSR 此酶催化的反應(yīng)： P260 反應(yīng)式 當(dāng)有 Kcat抑制劑時(shí)，此抑制劑被催化生成連丙二烯結(jié)構(gòu)，連丙二烯易與 His 咪唑反應(yīng)，使酶失 ２１ 活。 （ 2）、 Kcat型專一性不可逆抑制劑 這種抑制劑是根據(jù)酶的催化過(guò)程來(lái)設(shè)計(jì)的，它們與底物類似，既能與酶結(jié)合，也能被催化發(fā)生反應(yīng)，在其分子中具有潛伏反應(yīng)基團(tuán)（ latent reactive group），該基團(tuán)會(huì)被酶催化而活化，并立即與酶活性中心某基團(tuán)進(jìn)行不可逆結(jié)合，使酶受抑制。 舉例： 胰凝乳蛋白酶的 Ks 型不可逆抑制劑：對(duì)一甲苯磺酰 L苯丙氨酰氯甲烷（ TPCK）與該酶的最佳底物對(duì) 甲苯磺酰 L苯丙氨酸甲酯的結(jié)構(gòu)相似，都含有對(duì) 甲苯磺酰 L苯丙氨?；竿ㄟ^(guò)對(duì)這個(gè)基團(tuán)的強(qiáng)親和力 ，把 TPCK 誤認(rèn)為底物而與之結(jié)合，形成 Ks 很小的非共價(jià)絡(luò)合物。 （ 1）、 Ks 型專一性不可逆抑制劑 Ks 型抑制劑不僅具有與底物相似的、可與酶結(jié)合的基團(tuán)，同時(shí)還有一個(gè)能與酶的其它基團(tuán)反應(yīng)的活潑基團(tuán)。 ２０ （ 6）、 含活潑雙鍵試劑（與 — ＳＨ、 — ＮＨ ２ 反應(yīng)） Ｎ — 乙基順丁烯二酰亞胺 圖 （ 7）、 親電試劑 四硝基甲烷，可使 Tyr 硝基化。 （ 4）、 重金屬 Ag、 Cu、 Hg、 Cd、 Pb 能使大多數(shù)酶失活， EDTA 可解除。 Ｐ 258 結(jié)構(gòu)式：磷酰化劑與 DFP P259 反應(yīng)式：磷?；瘎┡c膽堿酯酶形成磷酰化膽堿酯酶 解毒劑： PAM（解磷定），可以把酶上的磷酸根除去。這類化合物的作用機(jī)理是強(qiáng)烈地抑制與中樞神經(jīng)系統(tǒng)有關(guān)的乙酰膽堿脂酶，使乙酰膽堿不能分解為乙酰和膽堿。它們不但能和酶分子中的必需 基團(tuán)作用，同時(shí)也能和相應(yīng)的非必需基團(tuán)作用。 研究抑制劑對(duì)酶的作用有重大的意義： （ 1） 藥物作用機(jī)理和抑制劑型藥物的設(shè)計(jì)與開發(fā)：抗癌藥 （ 2） 對(duì)生物體的代謝途徑進(jìn)行認(rèn)為調(diào)控，代謝控制發(fā)酵 １９ （ 3） 研究酶的活性中心的構(gòu)象及其化學(xué)功能基團(tuán)，不僅可以設(shè)計(jì)農(nóng)藥，而且也是酶工程和化學(xué)修飾酶、酶工業(yè)的基礎(chǔ) （一） 不可逆抑制作用（非專性必、專一性） 抑制劑與酶活性中心基團(tuán)共價(jià)結(jié)合，使酶的活性下降，無(wú)法用透析法除去抑制劑。 抑制作用：使酶活力下降但并不引起酶蛋白變性的作用稱為抑制作用。 ②金屬螯合劑（ EDTA）能去除酶中重金屬離子，解除抑制作用。 （ 2） 不同離子之間有拮抗作用，如 Na+與 K+、 Mg+與 Ca+，但 Mg+與 Zn+?？商娲?。 有的金屬離子通過(guò)生成螯合物，在酶與底物結(jié)合中起橋梁作用。 無(wú)機(jī)離子的激活作用 （ 1）金屬離子： K+ 、 Na+、 Mg2+ 、 Zn2+、 Fe 2+ 、 Ca2+ （ 2）陰離子： cl、 Br （ 3）氫離子 許多金屬離子是酶的輔助因子，是酶的組成成分，參與催化反應(yīng)中的電子傳遞。 activator 激活劑作用包括兩種情況： 一種是由于激活劑的存在，使一些本來(lái)有活性的酶活性進(jìn)一步提高，這一類激活劑主要是離子或簡(jiǎn)單有機(jī)化合物。 Vmax = K3 [E] ][ ][max SK SVV m??][][ ][][][][33ESK SKSKSEKVmm????? １８ [S]過(guò)量且不變時(shí)， v∝ [E]。 ②干粉，可在室溫下放置一段時(shí)間，長(zhǎng)期保存，應(yīng)在低溫冰箱中。 圖 酶濃度高、不純、有底物、抑制劑和保護(hù)劑會(huì)使穩(wěn)定性溫度增高。 酶的穩(wěn)定性溫度有一定的時(shí)間限制。 溫血?jiǎng)游锏拿?，最適溫度 35℃ — 40℃，植物酶最適溫度 40℃ — 50℃，細(xì)菌 Taq DNA聚合酶 70℃。 最適溫度就是這兩種因素綜合作用的結(jié)果。 ②提高溫度，酶變性失活。 P254 圖 49 酶的 pH— 酶活曲線 五、 溫度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響。 曲線 B 說(shuō)明，在 ~8 及 5~ 范圍內(nèi)反應(yīng)速度的降低，不是由于酶蛋白變性失 活造成的，而是由于酶或底物形成了不正常的解離，而在 pH ＞ 8 和 pH＜ 5 范圍，則是由兩種因素共同作用的結(jié)果。 穩(wěn)定性 pH：在一定 pH 范圍內(nèi)，酶不會(huì)變性失活，此范圍稱酶的穩(wěn)定性 pH。 2．酶的最適 pH 和穩(wěn)定性 pH 最適 pH：使酶促反應(yīng)速度達(dá)到最大時(shí)的介質(zhì) pH。 ②影響酶和底物分子解離狀態(tài)，尤其是酶活性中心的解離狀態(tài)，最終影響 ES 形成。 P252 如糖原磷酸化酶 乒乓反應(yīng)機(jī)理 先結(jié)合第一個(gè)底物 A，釋放第一個(gè)產(chǎn)物 P，酶的構(gòu)象發(fā)生變化，結(jié)合第二個(gè)底物 B，釋放第二個(gè)產(chǎn)物 Q。 雙底物酶促反應(yīng)已知有三種機(jī)理 有序順序反應(yīng)機(jī)理 底物 A、 B 與酶結(jié)合的順序是一定的，產(chǎn)物 P、 Q 的釋放順序也是一定的。 V— V/[S]作圖法 P250 圖 47 三、 多底物的酶促反應(yīng) 前面討論的米氏方程（推導(dǎo)米氏方程時(shí)用的是單底物），適用于單底物酶促反應(yīng)，如異構(gòu)、水解及大部分裂合反應(yīng)，不適用于多底物反應(yīng)。 如當(dāng)選 [S]為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 10 時(shí) 1/[S]為 、 、 、 、 、 、 、 、 、 。 如當(dāng) Km=1 105mol/L時(shí)，實(shí)驗(yàn)所取底物濃度范圍應(yīng)在 105－ 105mol/L。 若 [S]范圍在 —20 Km ，直線斜率太小。 設(shè)定達(dá)到最大反應(yīng)速度的 倍時(shí)，所需底物濃度為 [S] [S]=9Km 同理有： [S]=4Km [S]= [S]= [S]=1Km [S]=1/9Km [S] /[S]=81 [S][S]=21 （四） Km和 Vmax的求解方法 雙倒數(shù)作圖法 要從實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)所得到的 v[S]曲線來(lái)直接決定 Vmax是很困難的，也不易求出 Km值。 問(wèn)題： （ 1） Km越小，底物親和力越大（ X） （ 2） Ks 越小，底物親和力越大（√） （ 3） 天然底物就是親和力最大的底物（ X） （ 4） 天然底物就是 Km值最小的底物（√） Km與米式方程的實(shí)際用途 已知 V求 [S] 已知 [S]求 V 相對(duì)速度（酶 活性中心被占據(jù)分?jǐn)?shù) Y）： 當(dāng) v=Vmax時(shí)，表明酶的活性部位已全部被底物占據(jù)， v 與 [S]無(wú)關(guān)，只和 [Et]成正比。 Km、 Ks 與底物親和力 Km稱米式常數(shù)， Km=（ K2+K3）／ K1 ，從某種意義上講， Km是 ES 分解速度（ K2+K3）與形成速度（ K1）的比值，它包含 ES 解離趨勢(shì)（ K2／ K1）和產(chǎn)物形成趨勢(shì)（ K3／ K1） 。 Km與天然底物 如果一個(gè)酶有幾種底物，則每一種底物各有一個(gè)特定的 Km，其中 Km最小的底物稱該酶的最適底物或天然底物。不同的酶 Km值不同。 L1 Km是酶的特征常數(shù)之一。 單位：與底物濃度的單位一致， mol k1（ [E] [ES]） [S] = k2[ES]+k3[ES] 反應(yīng)速度： Vmax=k3 [E] Km稱米氏常數(shù)，當(dāng) Km及 Vmax已知時(shí)，即可確定酶反應(yīng)速度與底物濃度的關(guān)系。 穩(wěn)態(tài)平衡假說(shuō)的貢獻(xiàn)在于第②點(diǎn)。 ES 的生成速度： K1（ [E] [ES]） [S] ES 的分解速度： K2[ES] K1（ [E] [ES]） [S] = K2[ES] 反應(yīng)速度： KS現(xiàn)在稱為底物常數(shù) Briggs 和 Haldane 的“穩(wěn)態(tài)平衡假說(shuō)”及其對(duì)米式方程的發(fā)展： ][ ][*max SK SVV m??][ ]][[][ 121 SKK SEKES ??][][][]][[][m ax1233SKSVSKKSEKESKVS ??????? ???? ?? ??? ???? ??? 43 31 KK EPKESKSE １２ 穩(wěn)態(tài) 平衡 假說(shuō) ： [ES]的的生成與分解處于動(dòng)態(tài)平衡（穩(wěn)態(tài)），有時(shí)必須考慮 [ES]分解成產(chǎn)物 P 對(duì)于 [ES]動(dòng)態(tài)平衡的影響（ [ES]分解速度）。 ② 游離的酶與底物形成 ES 的速度極快， E + S ES，而 ES 形成產(chǎn)物的速度極慢， ES分解成產(chǎn)物 P 對(duì)于 [ES]濃度的動(dòng)態(tài)平衡沒有影響，不予考慮。 米式學(xué)說(shuō)： 初速度 V 1/2 Vmax 一級(jí)反應(yīng) 零級(jí)反應(yīng) 混合級(jí)反應(yīng) Vmax Km [S] １１ 1913 年， Michaelis 和 Menten繼承和發(fā)展了中間產(chǎn)物學(xué)說(shuō)，在前人工作基礎(chǔ)上提出酶促動(dòng)力學(xué)的 基本原理，并以數(shù)學(xué)公式表明了底物濃度與酶促反應(yīng)速度的定量關(guān)系，稱米式學(xué)說(shuō)： （二） 米式方程的導(dǎo)出： 基于快速平衡假說(shuō) —— 早年的米式方程 最初， Michaelis 和 Menten是根據(jù)“快速平衡假說(shuō)”推出米式方程。 中間產(chǎn)物假說(shuō)： 酶與底物先絡(luò)合成一個(gè)中間產(chǎn)物，然后中間產(chǎn)物進(jìn)一步分解成產(chǎn)物和游離的酶。 第一步總活力每一步比活力第一步總活力每一步比活力 １０ （一） 底物濃度對(duì)酶促反應(yīng)速度的影響 —— 米式學(xué)說(shuō)的提出 1903 Henri 研究蔗糖水解反應(yīng)。 二、 底物濃度對(duì)酶促反 應(yīng)速度的影響 單底物酶促反應(yīng)，包括異構(gòu)酶、水解酶及大部分裂合催化的反應(yīng)。 亞基或催化中心活性定義：每 mol 的 active subunit或 active center 在一秒內(nèi)轉(zhuǎn)化的 substrate 的mol 數(shù)，稱為轉(zhuǎn)換數(shù) Kcat P244 圖表 4— 4 轉(zhuǎn)換數(shù)的倒數(shù)即為催化周期：一個(gè)酶分子每催化一個(gè)底物分子所需的時(shí)間。 步驟 1 2 3 4 總活力（ U） 6 4 3 2 總蛋白質(zhì)（ mg） 20 10 5 2 比活力（ U/mg） 6/20 4/10 3/5 2/2 酶的提純過(guò)程中，總蛋白減少，總活力減少，比活力增高。 有時(shí)用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少個(gè)活力單位表示。酶的比活力是分析酶的純度是重要指標(biāo)。 1g 酶制劑溶于 1000ml H2O，取 與 2%的 starch 20ml 反應(yīng)， ， 10 分鐘完全液化，求 ９ 酶活力。 如 淀粉酶，兩種定義 A： 1 g可溶性 starch，在 1h內(nèi)液化所需的 enzyme 量。 凝膠電泳法測(cè)活： 37℃， 1 小時(shí)，使 1ugλDNA 完全水解的酶量為 1 個(gè)酶單位。 如 ：限制性核酸內(nèi)切酶 用粘度法測(cè)活性：定義為 30℃， 1 分鐘，使底物 DNA 溶液的比粘度下降 25%的酶量為 1 個(gè)酶單位。特定條件： 25℃ pH 及底物濃度采用最適條件（有時(shí)底物分子量不確定時(shí)，可用轉(zhuǎn)化底物中 1umol