【正文】 nidins orthogonal Table 試管號(hào) 因素 原花青素得率 丙酮濃度 微波功率 微波作用時(shí)間 料液比 （ %） 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 K1 K2 K3 k1 k2 k3 表 2 總酚正交實(shí)驗(yàn)表 Table2 Total phenol orthogonal Table 試管號(hào) 因素 總酚得率 丙酮濃度 微波功率 微波作用時(shí)間 料液 比 （ mg/g) 1 1 1 1 1 2 1 2 2 2 3 1 3 3 3 4 2 1 2 3 5 2 2 3 1 6 2 3 1 2 7 3 1 3 2 8 3 2 1 3 9 3 3 2 1 22 K1 K2 K3 k1 k2 k3 重復(fù)實(shí)驗(yàn) 02468101214原花青素 總酚得率重復(fù)試驗(yàn)得率（%) 圖 10 重復(fù)實(shí)驗(yàn) Fig10 Repeat experiments 經(jīng)過(guò)正交試驗(yàn)確定最佳的微波輔助提取原花青素的 條件是，控制微波作用時(shí)間為 90s，微波的輸出功率為 80%（即 560W），并且配制丙酮濃度為 60%，料液比為 1： 25（ 1g:25mL），通過(guò)重復(fù)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，利用最佳的實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)的原花青素和總酚的得率是所有單因素實(shí)驗(yàn)中最高的。 萃取次數(shù)的影響 012345670 1 2 3 4 5萃取次數(shù)得率（%)原花青素 總酚 圖 8 萃取次數(shù)的影響 Fig8 Extraction number of Impact 如（圖 8）所示，當(dāng)萃取次數(shù)達(dá)到 3 次以后，原花青素和總酚的得率都趨于平行，表明再做多余的萃取次 數(shù)已經(jīng)沒(méi)有必要了。 料液比的影響 012345671:10 1:15 1:20 1:25 1:30 1:35料液比得率（%）原花青素 總酚 圖 7 料液比的影響 Fig7 Feed ratio of Impact 20 在微波輸出功率，微波作用時(shí)間都一定時(shí)，通過(guò)調(diào)整料液比來(lái)觀察其對(duì)原花青素和總酚得率的影響。 微波萃取功率的影響 01234567890% 20% 40% 60% 80% 100% 120%微波功率得率（%g)原花青素 總酚 圖 6 微波萃取功率的影響 Fig6 Microwave Power Extraction of Impact 在其它條件不變的情況下考慮通過(guò)改變微波的輸出功率對(duì)原花青素和總酚的得率的影響。 溶劑濃度選擇 0246810120% 20% 40% 60% 80% 100%溶劑濃度得率（%)原花青素 總酚 圖 4 溶劑濃度選擇 Fig4 Solvent concentration choice 如（圖 4）所示，用不同濃度的丙酮作為萃取劑，原花青素和總酚的得率都是在丙酮濃度在 60%是達(dá)到最大值。 水平 因素 溶劑容度 A 萃取功率 B 萃取時(shí)間 C 料液比 D 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 3 3 3 3 3 2 結(jié)果與分析 標(biāo)準(zhǔn)曲線 00 吸光度值濃度(mg/mL)： 圖 1 總酚標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig1 Total phenol standard curve y（總酚） =+ R2 = 17 00 吸光度值濃度(mg/mL) 圖 2 原花青素含量標(biāo)準(zhǔn)曲線 Fig2 Proanthocyanidins content standard curve y（ 原花青素） = + R2 = R 值都在 以上，滿足線性回歸。 pH 值對(duì)萃取得率的影響 精密稱取 6 份 的蓮房粉，置于 250mL 三角瓶中，加入適量的選定溶劑，用 5moL/l 鹽酸來(lái)調(diào)節(jié) pH 分別為 7，于室溫下浸提，以提取率為衡量指標(biāo)，對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 料液比的影響 精密稱取 5 份 的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，微波功率為中火（ 80%功率）微波作用時(shí)間 90s 后，以提取率為衡量指標(biāo)考察了料液比（ 1： 1： 1 1： 1： 2 1： 1： 35（ M/V））對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 微波作用時(shí)間的影響 精密稱取 7 份 的蓮房粉放入錐形瓶中，以選定溶劑為提取劑，微波功率一定 (80%輸出功率 )，料液比一定，微波作用一定時(shí)間后一提取綠為衡量指標(biāo)，考察了微波作用時(shí)間（ 30s、 40s、 50s、 60s、 70s、 80s、 90s、 100s）對(duì)總酚和原花青素提取效果的影響。 單因素實(shí)驗(yàn) 溶劑選擇 精密稱取 4 份 的蓮房粉放入 100mL 的燒杯中，微波功率一定，料液比一定，微波作用一定時(shí)間，以提取綠為衡量標(biāo)準(zhǔn)，考察不同溶劑 [70%的丙酮、70%的乙醇、 70%的甲醇和水（加入亞硫酸氫鈉 1%） ]對(duì)總多酚和原花青素提取效果的影響，確定一種作為后續(xù)溶劑。依次移取 的對(duì)比溶液到對(duì)應(yīng)的容量瓶中，再依次加入 香草醛 甲醇， 濃鹽酸，混合均勻后在水浴鍋中 20℃反應(yīng) 15 分鐘。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精密稱取兒茶素（對(duì)照品） 用去離子水定容到 ，得 。 原花青素含量的測(cè)定 香草醛 濃鹽酸法 . 配制試劑： 。 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：精確稱取沒(méi)食子酸 用水溶解并定容到 10mL 得，精確吸取對(duì)照樣品溶液 、 、 、 、 、 于 10mL 容量瓶中，再加入 1mL Folinclocalteau 試劑，搖勻后再加入 2mL 15%碳酸鈉溶液，定容到 10mL，室溫下反應(yīng) 2 小時(shí)后測(cè)定 A760，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。 總酚含量的測(cè)定 Folinclocalteau 法。 1 材料與方法 試劑與儀器 試劑 沒(méi)食子酸 生物試劑 中國(guó)藥品生物檢定所 兒茶素 生物試劑 中國(guó)藥品生物檢定所 乙醇 分析純 江蘇省宜興市興洋企業(yè) 濃鹽酸 分析純 溫州天盛電化有限公司 香草醛 分析純 青島裕達(dá)精細(xì) 化工有限公司 甲醇 分析純 江蘇省宜興市興洋企業(yè) NaHCO3 分析純 上海四星醫(yī)藥科技工貿(mào)公司 Folinclocalteau 分析純 Sigma 公司 兒茶素，沒(méi)食子酸 分析純 Sigma 公司 蓮房，蓮子殼， 分析純 Sigma 公司 器材與儀器 722 分光光度計(jì) 上海精密科學(xué)儀器有限公司 14 微波爐 LG 電子（天津）電器有限公司 恒溫烘箱 101A－ 3S 上海意豐電爐有限公司 電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司 大小燒杯、錐形瓶若干、不同規(guī)格的離心管、滴管、移液管、玻璃 棒、移液槍等。 本實(shí)驗(yàn)就是通過(guò)微波輔助的方法來(lái)提取原花青素，通過(guò)控制改變微波的輸出功率、微波作用時(shí)間，原材料與試劑的料液比及萃取次數(shù)等條件來(lái)探究微波富足后提取的具體效果，旨在找出一個(gè)最佳的工藝條件，并利用原花青素的初提液進(jìn)行抗氧化試驗(yàn)，以此來(lái)探究原花青素的抗氧化能力、清除自由基的能力，通 過(guò)證明其具有抗氧化能力來(lái)說(shuō)明原花青素在抗衰老、護(hù)膚等方面是有功效的。因此迫切需要改進(jìn)提取原花青素的方法，經(jīng)過(guò)科研工作者的不斷努力、實(shí)驗(yàn)，終于探究出了利用改變外界條件的方法來(lái)輔助提取原花青素的方法。 4. 課題主要研究?jī)?nèi)容 根據(jù)本文的研究目的，將從以下四部分研究。旨在為提高蓮房、蓮子殼中原花青素的提取率， 為提高蓮房，蓮子殼的利用率和應(yīng)用價(jià)值，包括在藥理方面、營(yíng)養(yǎng)方面和人類生命方面等的產(chǎn)品的 開(kāi)發(fā)提供參考，為蓮資源開(kāi)發(fā)應(yīng)用開(kāi)辟新途徑。因此 .我們應(yīng)充分利用我國(guó)植物資源，如葡萄、甘薯、山植、花生、銀杏、大黃、蓮房等，結(jié)合我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥技術(shù)，開(kāi)發(fā)出適宜而又有功效的原花青素產(chǎn)品，使這一資 源的開(kāi)發(fā)和利用提高到一個(gè)新的階段。 原花青素經(jīng)過(guò)多年的開(kāi)發(fā)研究和臨床應(yīng)用，以其優(yōu)越的抗氧化活性為人們所青睞。改善皮膚的健康循環(huán)。一方面，它可促進(jìn)膠原蛋白形成適度的交聯(lián)，維護(hù)膠原的生合成；另一方面，它作為一種有效的自由基清除劑，可預(yù)防“過(guò)度交聯(lián)”這種反常生理狀況的發(fā)生，從而 阻止了皮膚皺紋和囊泡的出現(xiàn)，保持皮膚的柔順光滑。 原花青素具有獨(dú)特的化學(xué)和生理活性，在護(hù)膚品中起到多重作用，如抗衰老、抗紫外線、抗輻射、增白、保濕等，對(duì)多種因素造成的皮膚老化都有獨(dú)特的功效。 原花青素作為具有極強(qiáng)抗氧化性的天然功能性成分，在歐美被廣泛加入到各種普通食品如蛋糕、奶酪中，既作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑，又作為天然防腐劑來(lái)替代合成防腐劑 (如苯甲酸等 )，符 合人們回歸自然的要求，提高了食品的安全性。他還指出，聰明人每次服用花青素的時(shí)候，也要服用維生素 C，因?yàn)榛ㄇ嗨厥蔷S生素 C 的增效劑。在 Masquelier 發(fā)現(xiàn)花青素之前，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明：天 然來(lái)源的抗壞血酸防止壞血病的能力比較高，而純化了的或合成的抗壞血酸活性比較低。對(duì)于長(zhǎng)期漂泊海上而缺少新鮮水果和蔬菜的水手們來(lái)說(shuō)，壞血病曾經(jīng)是一種令人恐懼的流行病。人們還需要補(bǔ)充花青素，使維生素 C 發(fā)揮最大效益。長(zhǎng)期缺少維生素 C，人體會(huì)受到嚴(yán)重摧殘。研究表明，缺少維生素 C 的人是很普遍的。假如人體缺少維生素 C 長(zhǎng)達(dá)三個(gè)月，就會(huì)患所謂的壞血病。 維生素 C 的增效 劑 維生素 C 又叫抗壞血酸，維生素 C 和它的輔助因子是產(chǎn)生細(xì)胞內(nèi)部材料必需的成份，這些材料支持結(jié)締組織，形成像膠結(jié)劑那樣的物質(zhì)，用于修理骨骼、毛細(xì)血管、軟骨和牙質(zhì)。心臟負(fù)責(zé)抽壓血液；動(dòng)脈與靜脈血管輸送血液；而負(fù)責(zé)運(yùn)送營(yíng)養(yǎng)給細(xì)胞，又運(yùn)出廢物的是毛細(xì) 血管。毛細(xì)血管的阻力減少和滲透性改善，使細(xì)胞更容易吸收養(yǎng)分與排除廢物。 血液循環(huán) 在歐洲，為了改善血液循環(huán)、治療糖尿病性視網(wǎng)膜病、減輕水腫和抑制靜脈曲張等，花青素己用于臨床治療幾十年。參加者分成兩組，一組是晚上開(kāi)車的司機(jī)，一組是 10 整天和電腦屏幕為伴的人?；ㄇ嗨匾惨呀?jīng)用來(lái)防止糖尿病患者白內(nèi)障手術(shù)后的并發(fā)癥。法國(guó)允許用花青素治療該病已經(jīng)很多年了。法國(guó)飲君子患冠心病的人數(shù)也比不沾酒的人群低 30%到 40%，這是因?yàn)榉▏?guó)紅葡萄酒中含有花青素?；ㄇ嗨匾惨种平M胺產(chǎn)生，因而可減輕炎癥，幫助動(dòng)脈抗拒那些引發(fā)心血管病的誘變因素的沖擊。血管系統(tǒng)負(fù)責(zé)血液流動(dòng)，把血液送到所有細(xì)胞和組織。在羅馬尼亞，一種商品名為 Endotelon 的原花青素制劑已上市用于治療毛細(xì)血管疾病。法國(guó)的 Vennat 等還制成了含 80%原花青素的高劑量片 (50mg 片 )，改進(jìn)了處方，使此片劑能迅速而完全釋放，而且在不同條件下，貯存 10 個(gè)月仍有很 好穩(wěn)定性。 9 本項(xiàng)目是在前人研究發(fā)現(xiàn)蓮，特別是其非可食部分 — 蓮房中含有與人體健康和生命密切相關(guān)的重要天然活性物質(zhì)原 花青素，含量高于目前國(guó)內(nèi)外研究和利用最多的葡萄籽和皮，有望成為原花青素利用的新資源的基礎(chǔ)上開(kāi)展的 ！ 2 原花青素的應(yīng)用 在藥物方面的應(yīng)用 在法國(guó)，用葡萄籽原花青素制成的專利產(chǎn)品用于治療微循環(huán)疾病，包括眼睛與外周毛細(xì)血管通透性疾病及靜脈與淋巴功能不全。 隨著原花青素的深入研究和開(kāi)發(fā)，用于原花青素生產(chǎn)的資源較單一， 40 多年來(lái)主要利用的資源是葡萄籽和皮。皮膚 作為人體最大器官也有其固有的抗氧化酶系統(tǒng)，這種酶系統(tǒng)的平衡對(duì)于維持皮膚正常功能及延緩皮膚衰老具有重要的意義。原花青素能有效清除羥基自由基、超氧陰離子自由基、一氧化氮、過(guò)氧化氫等活性氧和活性氮，對(duì)各種原因引起的生物大分子損傷和脂質(zhì)過(guò)氧化均有抑制作用，并能調(diào)節(jié)或提高機(jī)體的抗氧化酶活性，降低脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物的生成。葡萄籽原花青素能激活正常人外周血 Th1 細(xì)胞產(chǎn)生 IFNγ（γ 干擾素），由 RTPCR 證明原花青素能有效促進(jìn) IFNγ mRNA 的轉(zhuǎn)錄 ，得到原花青素能促進(jìn) IFNγ的合成和分泌來(lái)增強(qiáng)免疫功能。1高水平者能顯著性降低 TGF223。1低水平者能顯著性提高 TGF223。 Mao T K 等探討 原花青素單體到十聚體對(duì)13 名健康人外周血單核細(xì)胞轉(zhuǎn)移生長(zhǎng)因子 (TGF)β 1的分泌調(diào)節(jié)作用。同時(shí)觀察 PHA 刺激的單核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄水平即IL1223。另外，高聚合度的原花青素對(duì) PHA 誘導(dǎo)的基因表達(dá)也有影響，與 PHA