【正文】 24.11.172024年11月17日星期日9時(shí)25分23秒24.11.17,謝謝大家！,。24.11.1724.11.1709:2509:25:2309:25:23Nov24 相信命運(yùn)，讓自己成長(zhǎng)，慢慢的長(zhǎng)大。2024年11月17日星期日9時(shí)25分23秒09:25:2317 November 2024 科學(xué)，你是國(guó)力的靈魂；同時(shí)又是社會(huì)發(fā)展的標(biāo)志。2024年11月17日星期日上午9時(shí)25分23秒09:25:2324.11.17 讓自己更加強(qiáng)大，更加專業(yè)，這才能讓自己更好。24.11.1724.11.1709:25:2309:25:23November 17, 2024 加強(qiáng)自身建設(shè)，增強(qiáng)個(gè)人的休養(yǎng)。24.11.1709:25:2309:25Nov2417Nov24 日復(fù)一日的努力只為成就美好的明天。24.11.1724.11.17Sunday, November 17, 2024 人生得意須盡歡，莫使金樽空對(duì)月。X光底片中顯現(xiàn)的陽性條帶 ，表明含有水稻的psbA基因序列。,?,菌落原位雜交示意圖,?,斑點(diǎn)狹縫雜交（dot and slot blotting ） （1）基本原理 斑點(diǎn)狹縫雜交是指將RNA或DNA變性后直接以形成斑點(diǎn)或狹縫的裝置點(diǎn)樣于硝酸纖維素濾膜上，與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法 （2）一般流程(手工點(diǎn)樣斑點(diǎn)雜交) 制備核酸樣品→將核酸樣品進(jìn)行變性處理→利用微量加樣器直接點(diǎn)樣于干燥的硝酸纖維素濾膜上→與標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交→放射自顯影或免疫酶法顯色顯示雜交結(jié)果 （3）特點(diǎn) 方法簡(jiǎn)單、迅速，適合于核算樣品的定性檢測(cè),?,膜上吸印雜交 （1）基本原理 膜上吸印雜交是將待測(cè)核酸序列片段通過吸印技術(shù)轉(zhuǎn)移結(jié)合到一定的固相支持物上，然后與存在于液相中標(biāo)記的核酸探針進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法,?,（2）固相支持物,硝酸纖維素濾膜(nitrocellulose filter membrane) 尼龍膜(nylon membrane) （3）吸印方法 虹吸轉(zhuǎn)移法 電泳轉(zhuǎn)移法 真空轉(zhuǎn)移法,?,?,?,?,（4）核酸膜上吸印雜交的主要類型,① Southern吸印雜交法—DNA 又叫做薩瑟恩DNA印跡雜交，它是由E. Southern于1975年首先設(shè)計(jì)出來的 A．基本原理 Southern吸印雜交法(Southern blot)是通過虹吸轉(zhuǎn)移法、電泳轉(zhuǎn)移法、真空轉(zhuǎn)移法等轉(zhuǎn)移方法將經(jīng)電泳分離及變性的DNA片段轉(zhuǎn)移到一定固相支持物（濾膜）上，然后進(jìn)行雜交并對(duì)其實(shí)行檢測(cè)的方法。 細(xì)胞原位雜交 組織切片原位雜交 DNADNA RNADNA 三類雜交 RNARNA 該法優(yōu)點(diǎn)： 不需提取核酸，故可完整保持組織或細(xì)胞的形態(tài)，因而更能準(zhǔn)確地反映組織細(xì)胞的功能狀態(tài)。 DNA與RNA雜交: A=U、 G≡C 。,?,末端標(biāo)記法 （1）基本原理 利用大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段、T4DNA聚合酶、T4多核苷酸激酶或末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶等相應(yīng)的活性將反應(yīng)體系中標(biāo)記核苷酸對(duì)DNA片段末端進(jìn)行標(biāo)記 （2）幾種方法 大腸桿菌DNA聚合酶I的Klenow片段末端標(biāo)記法 T4 DNA聚合酶末端標(biāo)記法 T4多核苷酸激酶標(biāo)記法 末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶標(biāo)記法,?,(二) 核酸分子的雜交 核酸分子雜交技術(shù)是在1968年由華盛頓卡內(nèi)基學(xué)院（Cavnegie Institute of Washington）的Roy Britten及其同事發(fā)明的 。 ③ 反應(yīng)產(chǎn)物的活性較高。 （3）特點(diǎn) ① Klenow片段沒有5‘→3’外切酶活性,反應(yīng)穩(wěn)定。 （1）原理 隨機(jī)引物合成雙鏈探針是使寡核苷酸引物與DNA模板結(jié)合，在Klenow酶的作用下，合成與模板互補(bǔ)的DNA探針。,?,（2）流程 在Mg2+的存在下，利用DNaseI的內(nèi)切核酸酶活性在待標(biāo)記的DNA雙鏈上隨機(jī)形成單鏈切刻→利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5’ →3’核酸外切酶活性在切刻處將舊鏈從5’逐步切除→以互補(bǔ)的DNA單鏈為模板，利用大腸桿菌DNA聚合酶I的5 →3’聚合酶活性將dNTP(其中一種或幾種經(jīng)過標(biāo)記)順序連接到切刻3’端的一OH上，延伸合成新的DNA單鏈，從而形成標(biāo)記的DNA探針。,?,核酸探針的類型和稱謂常有以下幾種：,基因組DNA探針 核酸探針 cDNA探針 (來源) RNA探針 化學(xué)合成的寡核苷酸探針,放射性標(biāo)記探針 32P、35S、3H、125I等標(biāo)記探針 探針標(biāo)記 (標(biāo)記物種類) 非放射性標(biāo)記探針 生物素、地高辛配體、熒光素,?,體內(nèi)標(biāo)記法 探針標(biāo)記法 化學(xué)標(biāo)記法 (方式) 體外標(biāo)記法 酶促標(biāo)記法 體內(nèi)標(biāo)記法：將經(jīng)放射性同位素標(biāo)記的化合物作為底物引入活細(xì)胞，經(jīng)細(xì)胞代謝處理而將生物大分子等加以標(biāo)記的方法 化學(xué)標(biāo)記法：利用標(biāo)記物分子上的活性基團(tuán)與探針分子上的基團(tuán)發(fā)生化學(xué)反應(yīng)而將標(biāo)記物接到探針分子上的方法 酶促標(biāo)記法：是指將標(biāo)記物預(yù)先標(biāo)記在核苷酸上，然后利用酶促方法將核苷酸摻入到探針分子中，或?qū)⒑塑账嵘系臉?biāo)記基團(tuán)交換到探針分子上的方法,?,根據(jù)酶促反應(yīng)的條件，又可將酶促標(biāo)記法分為： 切刻平移法 酶促標(biāo)記法 隨機(jī)引物法 末端標(biāo)記法 切刻平移法（nick translation） （1）原理 利用DNaseI內(nèi)切酶活性、DNA聚合酶I的5 ’ →3’ 聚合酶活性和5 ’→3’外切酶活性。,?,四、基因工程中的一些主要分子生物學(xué)方法 (一) 核酸分子探針的標(biāo)記 探針(probe): 是指在化學(xué)及生物學(xué)意義上能與特定的靶分子發(fā)生特異性相互作用，并可被特殊的方法所測(cè)定的分子。早期區(qū)在溶原生長(zhǎng)中一直表達(dá)，而晚期區(qū)僅在DNA復(fù)制后的一段時(shí)間中表達(dá)，產(chǎn)生病毒外殼結(jié)構(gòu)蛋白。 SV40病毒 ： 猿猴空泡病毒40(simian vacuolating virus 40)，即SV40病毒，是一種小型20面體的顆粒，外殼由VPl、VP2和VP3三種病毒蛋白構(gòu)成，中間包裝著長(zhǎng)5.2kb的環(huán)狀基因組DNA。