人重組白細(xì)胞介素-8在大腸桿菌的表達(dá)、鑒定(參考版)
2024-10-03 10:29本頁面
【正文】 本試驗(yàn)成功地構(gòu)建了hlL18重組原核表達(dá)質(zhì)粒，利用大腸桿菌成功地表達(dá)了重組蛋白，為進(jìn)一步研究hIL18的功能及應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。挑單個(gè)菌落接種于1ml LA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)后可進(jìn)一步提取質(zhì)粒進(jìn)行DNA電泳；或者用限制性內(nèi)切酶酶切后進(jìn)行DNA電泳，看是否含有目的基因片段。所以要對(duì)培養(yǎng)出的大腸桿菌做進(jìn)一步的鑒定。經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理后，小批量誘導(dǎo)hlL8表達(dá)，經(jīng)純化后，進(jìn)行ELISA雙抗體夾心法檢測，由圖2可以大致估算出hlL8的濃度[4]。所以綜合以上情況，本實(shí)驗(yàn)采用第三種辦法。分析這三種連接方法，第一種方法優(yōu)點(diǎn)是設(shè)計(jì)簡單，但是缺點(diǎn)也很明顯，連接反應(yīng)慢、片段位置易倒置、容易形成多個(gè)重復(fù)序列等。將hlL8cDNA片段插入pKpL3α質(zhì)粒中，有三種方法可選。而本試驗(yàn)酶切位點(diǎn)設(shè)計(jì)在下游3’引物上，并且增加了ccg三個(gè)堿基來保護(hù)酶切位點(diǎn)，是酶切更高效[3]。 引物二聚體及發(fā)夾結(jié)構(gòu)的能值過高（）易導(dǎo)致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應(yīng)不能正常進(jìn)行。 引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72℃左右可使復(fù)性條件最佳。引物的長度一般為15~30bp，常用的是18~27bp，但不應(yīng)大于27bp，因?yàn)檫^長會(huì)導(dǎo)致其延伸溫度大于74℃，不適于TaqDNA聚合酶進(jìn)行反應(yīng)[1]；引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當(dāng)沒有較高相似性片段，尤其是3’端相似性較高的序列，否則容易導(dǎo)致錯(cuò)配[1]；末位堿基為A的錯(cuò)配效率明顯高于其他3個(gè)堿基，因此應(yīng)當(dāng)避免在引物的3’端使用堿基A；引物序列的GC含量一般為40%~60%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。引物設(shè)計(jì)有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補(bǔ)；其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)；再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)ZML聚合反應(yīng)（即錯(cuò)配）。3 討論本實(shí)驗(yàn)首先通過PCR技術(shù)擴(kuò)增hlL18cDNA，反應(yīng)結(jié)束后取出少量做瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)圖1的結(jié)果可以看出，引物的設(shè)計(jì)和PCR反應(yīng)條件的設(shè)計(jì)是很成功的。1 2 3 4 5 6 7 8 9圖1 DNA瓊脂糖凝膠電泳分析注：PCR Products:228bp ELISA雙抗體夾心法檢測IL8含量所測OD值和標(biāo)準(zhǔn)曲線見表1和圖2。2 結(jié)果 DNA瓊脂糖凝膠電泳見圖1。終止反應(yīng)：加中止液（2mol/L H2SO4）。洗滌：同前。洗滌：同前。洗滌：加入洗滌液洗滌1分鐘/次，共3次。取出50μl涂于LA培養(yǎng)皿上（含氨芐青霉素），37℃倒置培養(yǎng)過夜，檢查轉(zhuǎn)化菌是否生成(只有轉(zhuǎn)化的細(xì)菌才能在平皿上生長)。加10μl連接好的質(zhì)粒D
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