人重組白細胞介素-8在大腸桿菌的表達、鑒定-免費閱讀
【正文】 由于本實驗沒有做這一步，所以有必要在這里討論一下。一是兩個平端連接；二是兩個粘端連接；三是一個平端和一個粘端連接。上下游引物的GC含量不能相差太大［2］。檢查擴增結(jié)果，9組都見一致的擴增區(qū)帶，PCR產(chǎn)物與設(shè)計的228bp相符，并無非特異性擴增，說明目的基因擴增成功。加樣：加入待測樣品、陰性對照及倍比稀釋的標準品，100μl/孔，放置濕盒中，37℃ 30分鐘。 轉(zhuǎn)化將無質(zhì)粒大腸桿菌pop2136接種于1ml LB培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)35小時。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。 限制性內(nèi)切酶消化取兩個Eppendorf管分別標記A、B，依次加入下列物質(zhì)構(gòu)建兩個反應(yīng)體系。取菌液1ml轉(zhuǎn)至Eppendorf管中，8000rpm，2分鐘離心，棄上清。10000rpm，10分鐘離心，棄上清， 70%乙醇，10000rpm，5分鐘離心，棄上清，空氣中干燥，溶于20μl TE。調(diào)節(jié)PCR儀，設(shè)置95℃預(yù)變5分鐘。 工具酶與試劑TaqDNA聚合酶及其buffer購于北聯(lián)生物醫(yī)學(xué)工程公司。白細胞介素8（Interleukin8）屬于趨化因子家族成員，其分子中含有CysXCys的三聯(lián)氨基酸序列，因而屬于CXC趨化因子亞家族（α家族）。結(jié)果 帶hIL8基因的重組pKpL3a質(zhì)粒成功轉(zhuǎn)化到Pop2136大腸桿菌中，經(jīng)誘導(dǎo)，表達了IL8并經(jīng)ELISA反應(yīng)檢測了其表達水平。利用重組技術(shù), 可使大腸桿菌成為生產(chǎn)IL8的生物工廠。 PCR引物的設(shè)計、合成上游5ˊ引物：agt gct aaa gaa ctt aga tgt；下游3ˊ引物：ccg tct aga tta tga att ata agc cct ct(內(nèi)含XbaⅠ酶切位點和TAA終止密碼)由Takara公司合成。向管中余下的40μl反應(yīng)體系中加入Klenow酶 1μl，室溫30分鐘，以修平擴增片段的3ˊ末端。取出凝膠板置溴化乙錠中染色20分鐘。10000rpm 5分鐘離心，棄上清，加入70%。10000rpm 10分鐘離心，棄上清，100μl 70%乙醇洗滌一次，干燥。 DNA連接在Eppendorf管中加入下列物質(zhì)構(gòu)建反應(yīng)體系進行連接反應(yīng)：H2O 、10T4 DNA連接酶buffer 、pKpL3α質(zhì)粒DNA 7μl、IL8 PCR產(chǎn)物5μl、T4 DNA連接酶1μl。取出50μl涂于LA培養(yǎng)皿上（含氨芐青霉素），37℃倒置培養(yǎng)過夜，檢查轉(zhuǎn)化菌是否生成(只有轉(zhuǎn)化的細菌才能在平皿上生長)。終止反應(yīng)：加中止液（2mol/L H2SO4）。引物設(shè)計有3條基本原則：首先引物與模板的序列要緊密互補
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