第十章核酸分子雜交技術(shù)(參考版)
2024-10-11 15:27本頁面
【正文】 gDNA以上 可直接在低熔點瓊脂糖溶液中進行標記 （三） PCR標記法： 將標記的核苷酸作為 PCR反 應(yīng)的底物，以待標記的 DNA為模板，經(jīng)PCR反應(yīng)，標記的核苷酸摻入到新合成的 DNA分子中 四、探針的純化 乙醇沉淀法：無水乙醇可以沉淀 DNA片段，可去除 dNTP和蛋白質(zhì) 凝膠過濾柱層析法：利用凝膠的分子篩作用，將大分子 DNA和小分子 dNTP、磷酸根離子及寡核苷酸（ 80bp)等物質(zhì)分離，常用凝膠基質(zhì)是 Sephadex G50 微柱離心法：其原理與上述凝膠過濾柱層析法相同，不同的是上述采用洗脫的方式純化探針，而此法則是利用離心的方式來純化探針 。另一單鏈 DNA模板同樣合成一條新的完全互補的 DNA鏈。 （一） RNA酶保護分析法 RNA酶保護分析法原理 RNaseA和 RNaseT1專一水解雜交體系中的單鏈 RNA，不水解探針 RNA與待測 RNA互補形成的雙鏈 RNA，使雜交分子得到保護，稱 RNA酶保護分析法。 （五） Southern雜交 預(yù)雜交：封閉膜上能與 DNA結(jié)合的位點 預(yù)雜交液為不含 DNA探針的雜交液 雜交：液相中的 DNA探針與膜上的待測 DNA雜交 雙鏈 DNA探針需加熱變性為單鏈，再雜交 洗膜：去除游離的放射性探針或非特異結(jié)合的 DNA （六）雜交結(jié)果檢測 放射自顯影：適用于放射性核素標記的探針 比色或化學發(fā)光檢測：適于非核素標記的探針 （七） Southern雜交在醫(yī)學中的應(yīng)用 酶切圖譜分析 特定基因定性和定量 基因突變分析 限制性片段長度多態(tài)性的分析 二、 Northern印跡雜交 基本原理和基本過程與 Southern blot基本相同 鑒別 RNA 探針可用 DNA或 RNA片段 待測樣品為總 RNA或 mRNA Northern印跡與 Southern 印跡的不同點 變性： RNA電泳前加熱變性、電泳時加變性劑保 持 RNA處于變性狀態(tài)， DNA電泳前和電泳 中不變性 轉(zhuǎn)膜： RNA轉(zhuǎn)膜前不需變性和中和處理 ,Southern 印跡時， DNA轉(zhuǎn)膜前需進行堿變性及中和處理 靶核酸為 RNA 三、斑點及狹縫印跡雜交 斑點印跡為圓形 狹縫印跡為線狀 鑒別 DNA、 RNA 簡單、快速，同一張膜可檢測多個樣品 特異性不高、不能鑒別核酸分子量 四、原位雜交 定義：將標記的核酸探針與固定在細胞或組織中的核酸進行雜交，稱原位雜交。 其基本原理是：容器中的轉(zhuǎn)移緩沖液含有高濃度的 NaCl和檸檬酸鈉，上層吸水紙的虹吸作用使緩沖液通過濾紙橋、濾紙、凝膠、硝酸纖維素濾膜向上運動，同時帶動凝膠中的 DNA片段垂直向上運動，凝膠中的 DNA片段
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