細(xì)菌遺傳學(xué)與基因工程(參考版)
2024-09-22 21:38本頁(yè)面
【正文】 檢測(cè)的結(jié)果可以是基因表達(dá)產(chǎn)物的積累效應(yīng)，因而可 檢測(cè)存在于蛋白質(zhì)之間的微弱的或暫時(shí)的相互作用 。 4） 作用信號(hào)是在融合基因表達(dá)后， 在細(xì)胞內(nèi)重建轉(zhuǎn)錄因子的作用而給出的， 省去純化蛋白質(zhì) 的繁瑣步驟。 2） 大規(guī)模的蛋白篩選，在較短時(shí)間內(nèi)對(duì)找到某些藥物對(duì)相關(guān)組織主要的作用蛋白， 對(duì)于藥物的修飾和改進(jìn) 明確方向。 e. 將共轉(zhuǎn)化的酵母菌株涂布于缺少 Leu， Trp和 His的培養(yǎng)基上， 篩選 表達(dá)相互作用的雜種蛋白的 陽(yáng)性菌落 。 c. 把已知的靶蛋白質(zhì)編碼基因克隆到 pGBT9的多克隆位點(diǎn)上，把所有cDNA都克隆到 pGAD424載體上，構(gòu)成 cDNA表達(dá)文庫(kù) 。 若用基因工程的方法，將 GAL4 AD和 BD分別克隆到不同的載體上，導(dǎo)入同一細(xì)胞株中表達(dá)，效應(yīng)基因無(wú)法被激活 ,但可把來自不同轉(zhuǎn)錄因子的 AD或 BD區(qū)域連成一個(gè)功能基因。 如 GAL4的 N端 1147aa是 DNA結(jié)合域（ BD），其 C端 768881aa是轉(zhuǎn)錄激活域（ AD）。 cDNA文庫(kù)構(gòu)建(引自O(shè)ld amp。 ④將雙鏈 cDNA重組到噬菌體載體或質(zhì)粒載體上。 ②合成 cDNA第一鏈。 用HacⅢAlul雙酶消化法 采用核酸內(nèi)切限制酶Sau3A進(jìn)行局部消化 基因組文庫(kù)技術(shù)(引自Griffiths et a96) cDNA文庫(kù)的構(gòu)建 ? cDNA文庫(kù) ： 以某生物的總 mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄酶成雙鏈 cDNA，連接到載體上，轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞后構(gòu)建的基因文庫(kù)。 基因組文庫(kù)的構(gòu)建 ? genomic library ： 整個(gè)基因組 DNA切成適當(dāng)長(zhǎng)度的片段，連接在載體上，轉(zhuǎn)化到宿主細(xì)胞中而構(gòu)建的克隆總體。 Transposon ? A transposon is a DNA sequence able to insert itself (or a copy of itself) at a new location in the genome, without having any sequence relationship with the target locus. ? 轉(zhuǎn)座 (transposition)：轉(zhuǎn)座子的轉(zhuǎn)移過程。 ? 轉(zhuǎn)座子 （ transposon Tn）： 一般 2kb，除攜帶與轉(zhuǎn)位有關(guān)的序列外，還帶有某些結(jié)構(gòu)基因 因此當(dāng) Tn插入某一基因時(shí)，可引起細(xì)菌性狀的變化。 ? 直到 1967年 Shapiro才在 （ transposable element）。 ? 又叫可移動(dòng)因子，它是指一段特定的 DNA序列，可從原來的位置上單獨(dú)復(fù)制或自動(dòng)脫落下來，經(jīng)環(huán)化后再插入到染色體其他位置，并對(duì)插入位點(diǎn)附近的基因產(chǎn)生各種遺傳學(xué)效應(yīng)。 第二節(jié)重組 DNA技術(shù)的基本操作程序 (四 )第四步 目的基因的檢測(cè)與鑒定 導(dǎo)入檢測(cè)： 表達(dá)檢測(cè) （ 1）轉(zhuǎn)錄檢測(cè) :DNA分子雜交技術(shù) （ 2）翻譯檢測(cè) :抗原 —抗體雜交（免疫）法 3. 鑒定： 個(gè)體生物學(xué)水平 鑒定 原位菌落（或噬菌斑）雜交 題：目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞后，是否可以穩(wěn)定維持和表達(dá)其遺傳特性，只有通過檢測(cè)與鑒定才能知道。 （ 1）植物：可以是卵細(xì)胞（受精卵）、體細(xì)胞（可經(jīng)組織培養(yǎng)成為完整個(gè)體）。 （ 3）導(dǎo)入微生物細(xì)胞 第二節(jié)重組 DNA技術(shù)的基本操作程序 （三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 轉(zhuǎn)化實(shí)質(zhì)：目的基因整合到受體細(xì)胞染色體基因組中。 第二節(jié)重組 DNA技術(shù)的基本操作程序 （三）將目的基因?qū)胧荏w細(xì)胞 轉(zhuǎn)化： 方法：受體種類不同，導(dǎo)入的方法不同。 第二節(jié)重組 DNA技術(shù)的基本操作程序 （二）第二步 基因表達(dá)載體的構(gòu)建 ? 1. 目的： 使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 如人的血紅蛋白基因、胰島素基因。 ? ①反轉(zhuǎn)錄法： 以目的基因轉(zhuǎn)錄成的信使 RNA為模板，反轉(zhuǎn)錄成互補(bǔ)的單鏈 DNA，然后在酶的作用下合成雙鏈 DNA，從而獲得所需要的基因。 ? 優(yōu)點(diǎn)：有了基因文庫(kù)，就可隨時(shí)從中提取所需要的目的基因，引入受體細(xì)胞使之表達(dá)。 ⑵ 噬菌體 ⑶動(dòng)植物病毒 它們來源不同，在大小、結(jié)構(gòu)、復(fù)制以及插入片段大小上也有很大差別 重組 DNA技術(shù)的主要技術(shù)原理 8．細(xì)菌的轉(zhuǎn)化 ? 一細(xì)菌菌株捕獲另一細(xì)菌菌株的 DNA，導(dǎo)致性狀特征發(fā)生遺傳改變 ? 供體菌株 –受體菌株 ? 大腸桿菌是最廣泛使用的實(shí)驗(yàn)菌株 ? CaCl2處理大腸桿菌細(xì)胞，使之呈感受態(tài)（ Competent Cells） ? 每 μ g DNA可得 107108個(gè)轉(zhuǎn)化子
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