x312基因工程的基本操作程序(參考版)
2024-09-22 18:16本頁面
【正文】 （ 4）培養(yǎng)進(jìn)入了 β珠蛋白基因的大腸桿菌，收集菌體，破碎后從中提取 β珠蛋白。 （ 3）將表達(dá)載體導(dǎo)入無四環(huán)素抗性的大腸桿菌中，然后在含有四環(huán)素的培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌。 55 ： 基本操作如下： （ 1）從小鼠中克隆出 β珠蛋白基因的編碼序列（ cDNA）。 如果想將一個抗病毒基因轉(zhuǎn)入小麥，也可以用農(nóng)桿菌，但要注意兩點：①要選擇合適的農(nóng)桿菌菌株，因為不是所有的農(nóng)桿菌菌株都可以侵染單子葉植物；②要加趨化和誘導(dǎo)的物質(zhì)，一般為乙酰丁香酮等，目的是使農(nóng)桿菌向植物組織的受傷部位靠攏（趨化性）和激活農(nóng)桿菌的 Vir區(qū)（誘導(dǎo)）的基因，使 TDNA轉(zhuǎn)移并插入到染色體 DNA上。 53 需要注意的是農(nóng)桿菌中不同的菌株，侵染能力有差別，在基因工程中需要加以選擇使用。近年來還發(fā)現(xiàn)一些中性糖，如L阿拉伯糖、 D木糖等也有誘導(dǎo)作用。根瘤農(nóng)桿菌具有趨化性，即植物的受傷組織會產(chǎn)生一些糖類和酚類物質(zhì)吸引根瘤農(nóng)桿菌向受傷組織集中。近年來，也有報道該菌對單子葉植物也有侵染能力。裸子植物對該菌也敏感。根瘤農(nóng)桿菌廣泛存在于雙子葉植物中。必須構(gòu)建上述元件的主要理由是： （ 1） 生物之間進(jìn)行基因交流，只有使用受體生物自身基因的啟動子才能比較有利于基因的表達(dá)； （ 2） 通過 cDNA文庫獲得的目的基因沒有啟動子，只將編碼序列導(dǎo)入受體生物中無法轉(zhuǎn)錄； （ 3） 目的基因是否導(dǎo)入受體生物中需要有篩選標(biāo)記； （ 4） 為了增強(qiáng)目的基因的表達(dá)水平，往往還要增加一些其他調(diào)控元件，如增強(qiáng)子等； （ 5） 有時需要確定目的基因表達(dá)的產(chǎn)物存在于細(xì)胞的什么部位，往往要加上可以標(biāo)識存在部位的基因（或做成目的基因與標(biāo)識基因的融合基因），如綠色熒光蛋白基因等。 假如讓你用基因工程的方法使大腸桿菌生產(chǎn)出人的胰島素，想一想，如何設(shè)計？ 嘗試設(shè)計 51 ： 不可以。但是，人凝血因子只存在于該轉(zhuǎn)基因羊的乳汁中。淘汰無表達(dá)產(chǎn)物的菌落，保留有表達(dá)產(chǎn)物的進(jìn)一步培養(yǎng)、研究。處理的受體細(xì)胞中真正攝入了目的基因的很少，必須將它從中檢測出來。 提示： ① DNA分子雜交技術(shù) 首先提取受體細(xì)胞中的 DNA，然后高溫解成單鏈，再與同位素標(biāo)記的 DNA探針雜交； ② 抗原－抗體雜交 所用到的抗體是用表達(dá)出的蛋白質(zhì)注射動物進(jìn)行免疫，產(chǎn)生相應(yīng)的抗體，并提取出而來的?？贵w與蛋白質(zhì)進(jìn)行 抗原－抗體 雜交，看是否有雜交帶。 ②檢測是否轉(zhuǎn)錄出了 mRNA，利用 DNA分子雜交技術(shù)， 目的基因DNA一條鏈（作探針）與受體細(xì)胞中提取的 mRNA雜交，看是否有雜交帶。 將細(xì)菌用 CaCl2處理，以增大細(xì)菌 細(xì)胞壁 和 細(xì)胞膜 的 通透性 。 36 構(gòu)建表達(dá)載體 組成 ? 目的基因 ? 啟動子 ? 終止子 ? 標(biāo)記基因 目的： 使目的基因在受體細(xì)胞中穩(wěn)定存在；可以遺傳給下一代；使目的基因能夠表達(dá)和發(fā)揮作用。 c、延伸（ 70℃ 75℃ ）：在 Taq酶的作用下，從 引物的 5′ 端 → 3′ 端延伸，合成與模板互補(bǔ) 的 。 33 PCR
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