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正文內(nèi)容

t載體與目的基因連接(參考版)

2024-08-27 23:57本頁(yè)面
  

【正文】  ?。?)在被細(xì)菌污染的桌面上噴灑70%乙醇,擦干桌面。按照編號(hào)找到冰箱中原菌液。  ?。?)提取到的3管質(zhì)粒樣品可用PCR法擴(kuò)增,或用酶切電泳法來(lái)鑒定其上是否含有外源插入片斷(方法見(jiàn)有關(guān)實(shí)驗(yàn))。  ?。?)37℃搖菌過(guò)夜后,用堿裂解法分別提取質(zhì)粒。用牙簽的尖部接觸轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基 上的一個(gè)白色菌落,然后將牙簽放入盛有3mL LB(含50mg/mL氨芐青霉素)的搖菌管中。   方法二:提質(zhì)粒再PCR或酶切鑒定  ?。?)在超凈工作臺(tái)中取3支無(wú)菌搖菌管,各加入3mL LB(含50mg/mL氨芐青霉素),用記號(hào)筆寫(xiě)好編號(hào)。  ?。?) 按照編號(hào)找到培養(yǎng)皿中的原菌斑。   dd water 16μl   10PCR buffer(不含MgCl2)   25mM MgCl2  ?。ǎ?  10μmol/L Primer1 1μl(—25pmoles)   10μmol/L primer2 1μl(—25pmoles)   模板質(zhì)粒 用小tip頭輕輕粘一下選中的白色菌落,再伸入PCR混合液中洗一洗   Taq酶 ()   總體積 25μl  ?。?)根據(jù)廠商的操作手冊(cè)設(shè)置PCR儀的循環(huán)程序(本實(shí)驗(yàn)室已經(jīng)設(shè)置為WZ): ① 94℃5min ②94℃1min ③60℃1min ④72℃1min50s⑤goto②29 times ⑥72℃10min  ?。?) PCR結(jié)束后,取10μl產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳(與原始插入片斷同時(shí)比對(duì))。 操作步驟 方法一:快速PCR篩選法  (1) 在轉(zhuǎn)化的平板培養(yǎng)基上隨機(jī)選取4個(gè)邊緣清晰的白色菌落,并用記號(hào)筆在其所在的培養(yǎng)皿底部玻璃背面畫(huà)圈做標(biāo)記編號(hào)。 (三). 轉(zhuǎn)化克隆的篩選和鑒定  器材 旋渦混合器,小鑷子,微量移液取樣器,移液器吸頭, 微量離心管,雙面離心管架,干式恒溫氣?。ɑ蚝銣厮″仯票鶛C(jī),恒溫?fù)u床,超凈工作臺(tái),酒精燈,無(wú)菌牙簽,搖菌管。  ?。?4) 觀察平板上長(zhǎng)出的菌落克隆,以菌落之間能互相分開(kāi)為好。   (12) 在涂好的培養(yǎng)皿上做上標(biāo)記,先放置在37℃恒溫培養(yǎng)箱中30min直到表面的液體都滲透到培養(yǎng)基里后,再倒置過(guò)來(lái)放入37℃恒溫培養(yǎng)箱過(guò)夜。   (11) 在超凈工作臺(tái)中取上述轉(zhuǎn)化混合液200μL,分別滴到含
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