【正文】 Bradford法是基于考馬斯亮藍(lán)250試。Lowry法（Lowry等，1951周＆戈?duì)柎奶梗?960。：薩雅等，1999）的吸光度是由于復(fù)合氨基酸/醌的電荷轉(zhuǎn)移引起的。紫外吸收法280 nm的方法（Stoscheck，1990）的吸光度是由于少數(shù)氨基酸的電子躍遷引起的。選擇這些方法是因?yàn)樗鼈兒苋菀走M(jìn)行，它們都是基于不同的反應(yīng)。正如薩雅，薩雅，Lichtig（1998）指出的，關(guān)于分光光度法測(cè)定蛋白質(zhì)的干擾物質(zhì)的研究有許多，然而，分光光度法或分光光度法與其他的方法如凱氏定氮法之間的比較研究并不多。使用分光光度法測(cè)定總蛋白質(zhì)的含量常用在這幾個(gè)領(lǐng)域，如臨床分析，生物化學(xué)，生理學(xué)，醫(yī)療的研究以及許多其他的領(lǐng)域。關(guān)鍵詞：蛋白質(zhì)分析；凱氏定氮法；Bradford法；分光光度法牛奶是幾種物質(zhì)（乳糖，脂肪，蛋白質(zhì)，氨基酸，尿素，肌酐等）的混合物，其組成取決于幾個(gè)因素，如遺傳育種程序，喂養(yǎng)計(jì)劃和氣候條件，等等。這意味著，Bradford法的高靈敏度足以克服由于樣品中的脂肪材料的濁度的問題。Bradford法（不含脂類提?。╋@示，測(cè)定所有樣品的總蛋白，其結(jié)果均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P0時(shí)05分），總氮用凱氏定氮法獲得最好的結(jié)果。用酪蛋白和牛血清白蛋白作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，福林酚試劑法（Lowry法）顯示了最低的酪蛋白或牛血清白蛋白可作為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的特定吸收率的變化。本文最重要的發(fā)現(xiàn)是，考馬斯亮藍(lán)法（Bradford法）可用于代替凱氏定氮法測(cè)定脫脂奶粉，全脂奶粉樣品（無脂質(zhì)提?。┑目偟鞍?。然而，目前還沒有一種有效的能快速準(zhǔn)確測(cè)定乳源蛋白質(zhì)和摻假的方法，因此，對(duì)于乳源蛋白質(zhì)快速檢測(cè)方法的研究對(duì)于保證乳品質(zhì)量和打擊摻假具有十分重要的意義。四、存在問題目前，乳粉蛋白質(zhì)的測(cè)定都采用國家標(biāo)準(zhǔn)GBT/《食品中蛋白質(zhì)的測(cè)定方法》，以凱氏定氮法為基礎(chǔ)：該方法步驟耗時(shí)長，操作繁瑣，但測(cè)定牛乳中總氮含量準(zhǔn)確度高，重復(fù)性好。三、發(fā)展趨勢(shì)隨著社會(huì)經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，消費(fèi)者對(duì)食品的需求從數(shù)量滿足型向質(zhì)量需求型和膳食營養(yǎng)型過渡，乳類食品作為一 種“最接近完善的食品”在改善膳食結(jié)構(gòu)、補(bǔ)充營養(yǎng)、增強(qiáng)體質(zhì)方面發(fā)揮著重要作用其質(zhì)量安全問題日益受到大眾關(guān)注，因此，對(duì)奶及奶制品中氮含量測(cè)定技術(shù)的發(fā)展，找到一種簡便易行的蛋白質(zhì)質(zhì)量評(píng)價(jià)的方法，可以建立起模型以便捷快速判定原料乳及乳制品中的蛋白質(zhì)是否存在摻假的可能，如未發(fā)現(xiàn)異常就可以直接進(jìn)入生產(chǎn)系統(tǒng)及流通領(lǐng)域，大大節(jié)約了檢測(cè)時(shí)間及檢測(cè)成本，并且可以有效地規(guī)避很多潛在的蛋白質(zhì)摻假風(fēng)險(xiǎn)；同時(shí)也為奶源系統(tǒng)對(duì)于奶源蛋白質(zhì)質(zhì)量提供了指導(dǎo)信息，大大提高了工作效率、降低了工作的難度。二、研究主要成果目前科學(xué)界經(jīng)常使用的關(guān)于乳及乳制品蛋白質(zhì)檢測(cè)的方法主要以傳統(tǒng)方法為主，國內(nèi)常用的經(jīng)典方法主要分為4種：凱氏定氮法、雙縮脲法(又被稱為Biuret方法)、Folin一酚試劑法(又稱為Lowry法)以及紫外吸收法，同時(shí)考馬斯亮藍(lán)法在最近十幾年的檢測(cè)方法中也經(jīng)常被使用。在經(jīng)典的凱氏定氮法的基礎(chǔ)上，為了能更為準(zhǔn)確的測(cè)定出氮的含量，人們對(duì)凱氏定氮法的基本環(huán)節(jié)進(jìn)行了改進(jìn)[46]。因此，近年來，人們發(fā)展了許多測(cè)定蛋白質(zhì)的方法。 Technology．2011六、指導(dǎo)教師意見 指導(dǎo)教師簽字： 年 月 日七、系級(jí)教學(xué)單位審核意見：審查結(jié)果： □ 通過 □ 完善后通過 □ 未通過 負(fù)責(zé)人簽字：年 月 日附錄2 文獻(xiàn)綜述附錄2 文獻(xiàn)綜述一、 課題國內(nèi)外發(fā)展現(xiàn)狀蛋白質(zhì)是乳及乳制品中的主要成分，它對(duì)乳制品的理化特性有著重要的影響。五、主要參考文獻(xiàn)[1] 吳茹怡．牛奶摻假物檢驗(yàn)方法研究[J]．大眾科技．2005，83(9)：9192[2] Liying wang．Study on protein quality evaluation of raw milk and milk products[D]．Northwest A amp。 第14～16周 分析比較幾種方法，并提出自己的看法。 第 5～10周 實(shí)驗(yàn)階段，用凱氏定氮法來準(zhǔn)確測(cè)定牛乳中蛋白質(zhì)的含量；然后分別用Bradford方法、雙縮脲法測(cè)定牛奶及在牛奶中摻入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液樣品的蛋白質(zhì)含量；應(yīng)用反相高效液相色譜法對(duì)牛乳蛋白和常見的三種可能摻假蛋白質(zhì)進(jìn)行定性分析。 四、研究工作進(jìn)度 第1 ～4周 查閱相關(guān)文獻(xiàn)，對(duì)測(cè)定奶制品中氮含量的方法進(jìn)行認(rèn)識(shí)了解。3. 考察Bradford方法、雙縮脲法對(duì)于牛乳中摻入不同比例的尿素溶液、三聚氰胺溶液樣品，樣品經(jīng)前處理后，看能否準(zhǔn)確測(cè)定牛乳蛋白含量。三、研究步驟、方法及措施1. 通過凱氏定氮法(國標(biāo)法)來準(zhǔn)確測(cè)定牛乳中蛋白質(zhì)的含量。從中找出最適合乳源蛋白質(zhì)測(cè)定的方法。二、研究的基本內(nèi)容，擬解決的主要問題本研究的目的是從幾種傳統(tǒng)的蛋白質(zhì)測(cè)定方法中來尋找適合乳品蛋白質(zhì)測(cè)定的方法。本課題目的將系統(tǒng)的定性定量分析奶制品中的主要蛋白質(zhì)，及各種蛋白質(zhì)的比例和百分含量。為此，急需建立適應(yīng)新?lián)郊偾闆r的快速、準(zhǔn)確的檢測(cè)方法。在原奶中摻雜摻假[1,2]，將水、蛋白粉、植物油、麥芽糊精等物質(zhì)加入鮮奶中，個(gè)別奶站還擅自在鮮奶中添加抗生素、雙氧水等，這種丑惡行為既影響了牛奶的品質(zhì)，又損害了消費(fèi)者的健康，在社會(huì)產(chǎn)生了極大的反響。作者知識(shí)水平有限如出現(xiàn)漏洞和錯(cuò)誤再所難免，望老師們諒解，多多批評(píng)指教。謝謝李老師。經(jīng)過本次設(shè)計(jì)我學(xué)到了許多液相色譜相關(guān)方面的知識(shí)，英語能力也有所提高。在李老師帶我做畢設(shè)的這段期間內(nèi)，使我受益匪淺。本論文得到了李阿丹老師的指導(dǎo)以及同學(xué)們的幫助，在此對(duì)他們表示衷心的感謝。參考文獻(xiàn) 參考文獻(xiàn)[1] 左士菊．牛奶中摻假物的鑒別[J]．山東畜牧獸醫(yī)．2008，29：48[2] 秦立虎，韓起文，孫武斌．鮮奶摻假的快速檢驗(yàn)技術(shù)[J]．四川食品與發(fā)酵．2005，41：5661[3] 韓起文，秦立虎，孫武斌．原料奶摻假的快速檢驗(yàn)技術(shù)[J]．中國奶牛．2005，7：4345[4] 程濤，孫艷波，李?。p縮脲法測(cè)定乳中酪蛋白含量[J]．中國乳品工業(yè)．2008，28(3)：3335[5] 張愛武．食品中蛋白質(zhì)測(cè)定方法的研究進(jìn)展[J]．農(nóng)產(chǎn)品加工另外，該方法可以快速準(zhǔn)確的測(cè)定三聚氰胺的含量。用反相高效液相色譜法對(duì)牛奶中的尿素和三聚氰胺的含量，由于實(shí)驗(yàn)條件的限制未能準(zhǔn)確測(cè)得其中尿素準(zhǔn)確的含量，但是其測(cè)定結(jié)果顯示，HPLC方法測(cè)兩種標(biāo)準(zhǔn)品相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差都很小，所以該法的重現(xiàn)性很好。使用雙縮脲法測(cè)定摻入尿素以及三聚氰胺的牛奶樣品的方法基本準(zhǔn)確，但是該法測(cè)得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性一般，因此需要通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到多組數(shù)據(jù)求平均值才可以得到比較準(zhǔn)確的結(jié)果。通過計(jì)算和分析以及結(jié)果對(duì)比得到了下述結(jié)論：凱氏定氮法測(cè)得的氮含量與純牛奶樣品包裝上的含量相比略微偏大，該方法測(cè)得的是氮含量為蛋白氮與非蛋白氮的總和。另外可能是由于現(xiàn)實(shí)的實(shí)驗(yàn)條件的限制，可能是由于前處理過后放置時(shí)間的原因而導(dǎo)致添加尿素后的樣品內(nèi)成分的變化。但是在對(duì)樣品中摻雜尿素后的樣品進(jìn)樣檢測(cè)時(shí)，出現(xiàn)了純樣品中在尿素出峰的位置都出了很大的峰，所以未能通過標(biāo)準(zhǔn)添加法對(duì)樣品中的尿素進(jìn)行定量分析。又由圖34可得， μg/mL，因此，%。做濃度峰面積圖，如圖37所示。反相高效液相色譜法測(cè)樣品中的三聚氰胺對(duì)純牛奶樣品以及摻入不同濃度三聚氰胺的牛奶樣品分別進(jìn)行進(jìn)樣分析，其高效液相色譜圖如圖36所示。究其原因，可能是牛奶樣品中的某種物質(zhì)在本實(shí)驗(yàn)的色譜條件下的出峰位置與尿素的出峰位置相近而與尿素峰重疊所致。由圖35可以看出，在檢測(cè)純樣品時(shí)尿素出峰的位置出了一個(gè)遠(yuǎn)大于高濃度的純尿素峰的峰。 反向高效液相色譜法測(cè)樣品中的尿素和三聚氰胺反相高效液相色譜法測(cè)樣品中的尿素對(duì)純牛奶樣品以及摻入不同濃度尿素的牛奶樣品分別進(jìn)行進(jìn)樣分析，其高效液相色譜圖如圖35所示。圖34 三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖34可知，三聚氰胺溶液在5~100 μg/mL的濃度在三聚氰胺的線性范圍之內(nèi)。表314 不同濃度的三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積數(shù)值濃度μg/mL5255075100峰面積(mAu*s)根據(jù)表314中的數(shù)據(jù)，、。圖33 尿素標(biāo)準(zhǔn)曲線由圖33可知，尿素溶液在1~20mg/mL的濃度在尿素的線性范圍之內(nèi)。表313 不同濃度的尿素標(biāo)準(zhǔn)溶液的峰面積數(shù)值濃度mg/mL15101520峰面積(mAu*s)根據(jù)表313中的數(shù)據(jù)，、。，考馬斯亮藍(lán)法的準(zhǔn)確性不如雙縮脲法得出的結(jié)果準(zhǔn)確，但是在理論上考馬斯亮藍(lán)法的準(zhǔn)確度應(yīng)該比雙縮脲法的準(zhǔn)確度高，通過查閱資料我們了解到，牛奶中的酪蛋白在酸性條件下會(huì)析出[34]，因而導(dǎo)致吸光度降低，所以用考馬斯亮藍(lán)法實(shí)際測(cè)的結(jié)果會(huì)比雙縮脲法的小。表312 考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)含量樣品號(hào)實(shí)測(cè)值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%16789結(jié)果分析%、%、%、%，%、%、%、%。以根據(jù)表311中測(cè)得的樣品的吸光度值在圖32所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(mg)，代入下式：蛋白質(zhì)含量（mg/mL）=標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（μg/mL)500(mL) 247。由此看來，使用考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定摻入尿素的牛奶樣品的方法與理論差值的誤差比較大，但是該法測(cè)得的數(shù)據(jù)的穩(wěn)定性和重現(xiàn)性好，因此該方法可以不通過進(jìn)行多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)就可以得到結(jié)果。[樣品體積（mL）1000]計(jì)算可得考馬斯亮藍(lán)法測(cè)定牛奶中摻入不同比例尿素溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表310所示。 考馬斯亮藍(lán)法對(duì)摻雜尿素的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理）中的方法用722型光柵分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)各摻入不同比例的尿素溶液的未知樣品溶液在595nm處的吸光度值A(chǔ)595nm，測(cè)得的數(shù)值如表39所示。根據(jù)上述數(shù)據(jù)作蛋白質(zhì)含量吸光度圖，得到考馬斯亮藍(lán)法測(cè)得的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線，如圖38所示。，測(cè)得的數(shù)值如表38所示。由于蛋白質(zhì)中氮元素的平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)為16%，又通過計(jì)算可知，尿素（CO(NH2)2）%，三聚氰胺(C3N3(NH2)3)%。由此看來，使用雙縮脲法測(cè)定摻入三聚氰胺的牛奶樣品的方法比較準(zhǔn)確，該法測(cè)得的數(shù)據(jù)的數(shù)值上的差異也不是很大，因此如通過多次重復(fù)實(shí)驗(yàn)得到多組數(shù)據(jù)求平均值可以得到更加準(zhǔn)確的結(jié)果。樣品體積（mL）計(jì)算可得雙縮脲法測(cè)定牛奶中摻入不同比例三聚氰胺溶液的蛋白質(zhì)的含量，如表37所示。 雙縮脲法對(duì)摻雜三聚氰胺的未知樣品溶液中的蛋白質(zhì)含量的測(cè)定實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)及處理同理可得用722型光柵分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)各摻入不同比例的三聚氰胺溶液的未知樣品溶液在550nm處的吸光度值A(chǔ)550nm，測(cè)得的數(shù)值如表36所示。表34 雙縮脲法測(cè)得的摻雜尿素溶液的未知樣品在550nm處的吸光度值A(chǔ)550nm試管編號(hào)12345吸光度值A(chǔ)550nm表35 雙縮脲法測(cè)定牛奶中摻入尿素溶液的蛋白質(zhì)含量樣品號(hào)實(shí)測(cè)值/ g/L平均值/ g/L理論值/ g/L誤差率/ %RSD/%12345結(jié)果分析%、%、%、%,%、%、%、%。以根據(jù)表34中測(cè)得的樣品的吸光度值在圖31所示的標(biāo)準(zhǔn)曲線上查出對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)含量(mg)，代入下式：蛋白質(zhì)含量（mg/mL）=標(biāo)準(zhǔn)曲線上查得的蛋白質(zhì)含量（mg/mL)50(mL) 247。圖31所示，雙縮脲法以酪蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，由所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線可知，其線性方程為Y=，相關(guān)系數(shù)為R2=，這表明酪蛋白與雙縮脲試劑的線性關(guān)系好，因此可知雙縮脲法所需的標(biāo)準(zhǔn)蛋白可以用酪蛋白。表33 雙縮脲法測(cè)得的標(biāo)準(zhǔn)酪蛋白溶液在550nm處的吸光度值A(chǔ)550nm蛋白質(zhì)含量/ mg/mL0吸光度值A(chǔ)550nm000圖31 雙縮脲法測(cè)得的酪蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線其對(duì)應(yīng)蛋白質(zhì)含量的吸光度的平均值分別為：0、。 g/100mL， g/100mL， g/100mL。 雙縮脲法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析 樣品摻雜處理中所需尿素和三聚氰胺溶液的濃度計(jì)算，使每毫升尿素溶液和三聚氰胺溶液的氮含量等于凱氏定氮法測(cè)得的牛奶的氮含量的方法對(duì)樣品進(jìn)行摻雜。該方法測(cè)得的蛋白質(zhì)含量為X= g/100mL， g/100mL，所以凱氏定氮法測(cè)得的氮含量是樣品中的蛋白氮與非蛋白氮的總和。第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 第3章 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析 凱氏定氮法的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)處理及結(jié)果分析，所得結(jié)果如表31所示表31 凱氏定氮法試驗(yàn)數(shù)據(jù)組號(hào)樣品編號(hào)V1/ mL空白樣品編號(hào)V2/ mLV1V2/ mL114225336 表中：V1 為樣品消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積；V2為空白樣消耗標(biāo)準(zhǔn)鹽酸體積。樣品的測(cè)定將2中制備好的樣品作為空白樣分別按3中1）和2）的色譜條件進(jìn)行進(jìn)樣分析。2）三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制：按以下色譜條件對(duì)三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行高效液相色譜檢測(cè)。圖22 高效液相色譜儀尿素及三聚氰胺標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制1