【正文】 2. 影響雜交穩(wěn)定性（影響解鏈溫度的）因素離子強(qiáng)度 在 NaCl 之間, 每?10單價(jià)陽離子，Tm?℃堿基組成 ATCG（在 NaCl 溶液中） ；去穩(wěn)定劑（destabilizer） DNADNA 雜交分子，每 1%formamide,Tm?℃；6M urea 可降低 Tm30℃堿基錯(cuò)配：每 1%的錯(cuò)配可使 Tm 降低 1℃。33附注：1. 雜交率的影響因素雜交溫度：雙鏈 DNA 分子，T=T m20—25℃可達(dá)最大雜交率，DNARNA 雜交分子則低于 Tm 值 1015℃。期間要換幾次DMF，直到藍(lán)色消失用去離子水洗膜在 37186。以下操作必須在通風(fēng)櫥中進(jìn)行：32將水浴鍋調(diào)到 5060186。當(dāng)預(yù)期的斑點(diǎn)出現(xiàn)時(shí)，可在 50mlTE 或無菌超純水中洗膜 5 分鐘中止反應(yīng)11) 照像記錄結(jié)果。5. 檢測（注意：為避免膜變干，在下一步試劑準(zhǔn)備好之前不要將上一步的試劑倒掉）1) 雜交和洗膜后，用 Maleic acid buffer 浸泡 15 分鐘2) 準(zhǔn)備 1Block solution： 用 Maleic acid buffer 10稀釋試劑6（10Blocking solution ） ，成 1的工作液，即每 9ml Maleic acid buffer中加入 1ml 10Blocking solution 混勻，現(xiàn)配現(xiàn)用3) 按 1ml/ cm2 的量取用 1Block solution，處理膜 30 分鐘4) 將 4試劑離心，按 1：5000 或 1：10000 加入 1Blocking solution，28 186。C 冷洗 2 次，每次 5 分鐘，洗滌過程中要輕輕搖動(dòng)用 SSC，% SDS 在 65 68186。C 處理 10 分鐘即可。注：含有探針的 DiG Easy Hyb 雜交液可重復(fù)利用，雜交結(jié)束后用槍吸出放入 離心管中于20186。 （不能用堿變性?。⒆冃缘奶结樇尤腩A(yù)熱的 DIG Easy Hyb（）中，混勻，避免泡沫31倒出預(yù)雜交液，加入探針和 DIG Easy Hyb 混合液繼續(xù)在 42 186。C 下充分潤濕變性：Dig 標(biāo)記的探針（約 25ng/ml）置沸水浴或 98186。注：先將洗干凈的雜交筒放入雜交爐中預(yù)熱，使筒蓋膨脹，并且在后續(xù)步驟中加入雜交液時(shí)，將瓶蓋始終放在爐中，防治液體泄漏預(yù)雜交 30 分鐘。C預(yù)熱一定體積的 DiG Easy Hyb（10ml/100cm2 膜）至雜交溫度 3742 186。C，T m=+(%G+C) (600/I)(I=length of hybrid in base pairs)。C搖動(dòng)溶解 5 分鐘；（2）計(jì)算雜交溫度：通常為 37186。顯色過程中不要搖動(dòng)10) 當(dāng)斑點(diǎn)或帶顯示出來后，用 50ml 滅菌的雙蒸水洗膜 5 分鐘，照相染色至 的 Control DNA 出現(xiàn)斑點(diǎn)，比較標(biāo)記的探針與 Control DNA 染色情況計(jì)算出地高辛標(biāo)記的 DNA 的量：如果 的探針及對(duì)照稀釋點(diǎn)都顯色，則探針標(biāo)記理想；如果 的對(duì)照顯色， 的標(biāo)記探針沒顯色，但 顯色，則計(jì)算探針濃度（約為理想濃度的 1/3）以確定雜交時(shí)加多少探針（25ng 探針/ml 雜交液） ；如果 的對(duì)照顯色，但標(biāo)記探針 的斑點(diǎn)沒顯色，則應(yīng)重新標(biāo)記探針。l9 0 50 02) 將上述稀釋的 29 號(hào)管的 control DNA 及探針 DNA 各取 1μl 點(diǎn)膜3) 120186。l307 5 5 45 1:10 pg/181。l5 5 3 45 1:10 pg/181。l3 15 2 35 1: 3 pg/181。l) From tubeDNA dilution buffer(μl)Dilution Final concentration1 Diluted inal 1ng/181。操作步驟如下：1) 根據(jù)表 1 DigHigh Prime DNA 標(biāo)記及檢測試劑盒理想條件下探針的標(biāo)記產(chǎn)量將標(biāo)記的探針稀釋到 1ng/μl，將試劑盒提供的 control DNA 稀釋到 1ng/μl (原始濃度是 5ng /μl)，然后按照表 2 系列稀釋探針及 control DNA表 1 DigHigh Prime DNA 標(biāo)記及檢測試劑盒理想條件下探針標(biāo)記產(chǎn)量Template DNA 1 h 20 h。2. 探針標(biāo)記效率檢測：將地高辛標(biāo)記好的探針系列稀釋，點(diǎn)到一條尼龍膜上，同時(shí)用地高辛標(biāo)記的 control DNA作對(duì)照標(biāo)準(zhǔn)，120186。 l EDTA（pH ）或 65 186。C 溫育 1 小時(shí)或過夜（最大到不超過 20 小時(shí)） 。 l 至變性 DNA 管，混勻并離心。C 10 分鐘，使 DNA 變性成單鏈并迅速冰浴冷卻。 l。l 體系）：1) 將 10ng1181。膜上探針洗脫再次使用膜前，必須洗去上次探針！(1) %SDS，SSC 10min(2) ，%SDS 23min(3) ， %SDS，SSC 20min只洗去探針，而不影響膜上的靶 DNA（因?yàn)?DNA 與膜是共價(jià)鍵結(jié)合，而 DNA與探針的結(jié)合是氫鍵結(jié)合） 。包膜：膜從洗膜液中撈出，在濾紙上晾干，膜表面無可見水膜為止（注意：不能太干，以防探針難以洗脫影響再次使用） ，用保鮮膜包膜，壓 X光片，置于20 或70℃ 3 —7 天（依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱掌握曝光時(shí)間）沖洗 X光片在暗室紅燈下取出 X光片，置入顯影液中至雜交帶顯現(xiàn)出來（顯影時(shí)間依據(jù)信號(hào)強(qiáng)弱及曝光時(shí)間長短可由幾秒鐘到 2 分鐘） ，轉(zhuǎn)入清水中漂洗，然后放入定影液中定影至清亮（約 10 分鐘） 。雜交效率受雜交速率及雜交穩(wěn)定性影響。l 雜交液，100℃變性（or NaOH 變性） ，加入雜交袋（盒）中（忌直接加于膜上） 。 。l) 1181。l) 1181。4．洗膜：用不同組成及離子強(qiáng)度的（嚴(yán)謹(jǐn)度）溶液，洗去膜上的封閉劑及非特異性雜交的探針實(shí)驗(yàn)材料及試劑：已轉(zhuǎn)移上 DNA 的尼龍膜， 32P 標(biāo)記的 dCTP，隨機(jī)引物，20SSC，10%SDS，X光片，顯影液及定影液等實(shí)驗(yàn)步驟：預(yù)雜交：將尼龍膜在 2SSC 中浸濕，放入雜交袋或雜交管中，加入適量雜交液（雜交液浸沒膜） ，趕氣泡，封口，放入 65℃的雜交箱或恒溫?fù)u床中，預(yù)雜交3 個(gè)小時(shí)以上，一般 612hrs。4 種 dNTPs 中的一種用放射性同位素標(biāo)記。The klenow fragment 去除了 E．Coli DNA polymerase I 的 5’→ 3’的外切酶活性，具有 5’→ 3’的聚合酶活性及 3’→ 5’ 外切酶活性；同位素標(biāo)記的探針 DNA 的平均長度與引物的濃度成反比 [=k/(lnPc)1/2， Pc 是引物的濃度]，一般可產(chǎn)生約 400600 bp 的標(biāo)記27產(chǎn)物；模板 DNA 一般采用線狀雙連 DNA。探針的標(biāo)記：體外標(biāo)記 DNA 或 RNA 的方法有多種。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆胀凰氐牟僮骷胺雷o(hù)方法；掌握預(yù)雜交、探針的標(biāo)記及分子雜交技術(shù)實(shí)驗(yàn)原理：依據(jù)堿基配對(duì)原則，用放射性同位素標(biāo)記的 DNA 探針，與固著在膜上的靶 DNA 雜交，經(jīng)放射自顯影，確定靶 DNA 的位置。思考：（1）為什么轉(zhuǎn)膜前要對(duì)凝膠預(yù)處理？如何處理？（2）怎樣提高轉(zhuǎn)移效率實(shí)驗(yàn)四 Southern 探針標(biāo)記及雜交探針的放射性同位素標(biāo)記與雜交雜交對(duì)于大的基因組，DNA 酶切圖譜憑肉眼是分辨不開的（EB 染色） ，因?yàn)榇笮〔坏鹊姆肿映尸F(xiàn)彌散分布，只有借助靈敏的放射性同位素（或其他發(fā)光物質(zhì)） ，將靶 DNA 在凝膠上（膜上）的帶型通過特定的探針與之雜交，轉(zhuǎn)換成 X 光片上直觀的帶型，才能進(jìn)行相關(guān)分析。9 轉(zhuǎn)移后的瓊脂糖凝膠用 EB 染色 10 分鐘，放到凝膠成像系統(tǒng)上觀察轉(zhuǎn)移效果（膠上是否有 DNA 殘留） 。，于凝膠成像系統(tǒng)上觀察轉(zhuǎn)移效果。大電泳槽一般用 1TAE 配制 250ml %的瓊脂糖凝膠，注意瓊脂糖的質(zhì)量、膠的濃度、厚度（5mm）及均一性 ； 制樣，點(diǎn)樣：DNA 樣品中指示劑量稍多電泳：一般 ， 使 DNA 遷移到適當(dāng)距離，一般指示劑約移動(dòng) 1011cm (大電泳槽：40V1215hrs，小電泳槽 30V45 hrs)2 2. 轉(zhuǎn)膜前的準(zhǔn)備：依據(jù)凝膠大小，每塊凝膠準(zhǔn)備兩張比膠稍大的濾紙，兩張用作鹽橋的濾紙，一張與膠同樣大小的尼龍膜，兩個(gè)玻璃盤、兩塊有機(jī)玻璃板、一根玻璃棒，比尼龍膜稍大的一疊（約 5 厘米厚）吸水紙等3. 凝膠的預(yù)處理:a) 從電泳槽中移出凝膠置于塑料板上，用切膠板把膠切成適當(dāng)大小，切去右上角（最后一個(gè)樣品的最前端）作為電泳方向記號(hào)b) 把凝膠翻面，放入加有足量的 的 HCl 玻璃盤中，輕輕搖動(dòng)約10min，使電泳指示劑溴酚藍(lán)變?yōu)辄S色為止（脫嘌呤）c) 倒去 HCl 溶液，加蒸餾水漂洗凝膠d) 倒去蒸餾水，加入足量變性緩沖液（NaOH/NaCl ）淹沒凝膠，輕輕搖動(dòng)變性 30 分鐘e) 倒去變性緩沖液，加蒸餾水漂洗f) 倒去蒸餾水，加入足量的中和緩沖液（Tris/NaCl ）淹沒凝膠，輕輕搖動(dòng)30 分鐘中和4 4. 另一玻璃盤中加入足量的轉(zhuǎn)膜緩沖液(10或 20SSC)，放上洗凈的玻璃板，用 23 張濾紙放在玻璃板上，兩端浸入轉(zhuǎn)膜液中搭制鹽橋（注意濾紙之間不能有氣泡）5 5. 在鹽橋?yàn)V紙上灑些轉(zhuǎn)膜液，立即將處理后的膠放在鹽橋上（注意凝膠與鹽橋之間不要有氣泡） ，膠的四周用塑料片與膠緊緊相連，防止短路（即放置吸水紙與鹽橋相接）6 6. 小心將膜覆蓋在凝膠上（注意膜與凝膠之間不要有氣泡） ，要求一次成功，膜一旦貼到凝膠不能移動(dòng)7 7. 膜上放 2 張濾紙，濾紙上放不少于 5cm 厚的吸水紙，放上玻板，其上壓約24350g 的重物，轉(zhuǎn)膜過夜8 8. 轉(zhuǎn)膜完畢，將膜小心取下，用兩張濾紙包住膜，置于 80100℃的真空干燥箱中，固定 2 小時(shí)（固定前不要用 2SSC 漂洗，雜交前可用 2SSC 漂洗膜） 。4．轉(zhuǎn)膜時(shí)間（duration of transfer）約 12 hrs取決于毛細(xì)管系統(tǒng)，DNA 大小，膠厚度(5 mm)及濃度(1%)。 3. 轉(zhuǎn)移緩沖液（transfer buffer）的選擇：尼龍膜：可用高鹽離子強(qiáng)度（SSC） ，也可用堿轉(zhuǎn)移（ NaOH） ，共價(jià)結(jié)合DNA 是最大優(yōu)點(diǎn)。經(jīng)毛細(xì)管（毛細(xì)吸附）作用，把 DNA 從凝膠上轉(zhuǎn)到膜上。實(shí)驗(yàn)?zāi)康模赫莆?Southern blotting 的原理及操作步驟實(shí)驗(yàn)原理：1. 轉(zhuǎn)膜的方式：一般采用向上的毛細(xì)管轉(zhuǎn)移2. 固相支持物的種類及選擇：硝酸纖維素膜：非共價(jià)結(jié)合，易脆，易丟失 DNA， 500 bp 的 DNA 效果差；尼龍膜（帶正電荷的）：高強(qiáng)度，不易破損，具有較大的 DNA 結(jié)合容量，它能夠吸附變性 DNA，核酸以共價(jià)結(jié)合方式不可逆的結(jié)合在尼龍膜上。22三、電泳、轉(zhuǎn)膜結(jié)果分析若水稻 DNA 呈現(xiàn)均勻連續(xù)分布的一片，則酶切效果好，否則需重做； DNA 被切爛：DNA 降解，重新提 DNA；DNA 切不動(dòng)：雜質(zhì)多（多糖，蛋白質(zhì)，酚類，有機(jī)溶劑等） ，重新純化；若是 BAC 克隆 DNA，酶切后應(yīng)出現(xiàn)多條很清晰的不同大小 DNA 帶。l10? buffer reaction EnzymeHindIII (15 0U/181。l）廠家配套試劑；35．計(jì)算據(jù)反應(yīng)條件所需要的各種試劑準(zhǔn)確用量：（ ml tube 中）DNA(35181。l DNA 于 % 凝膠電泳檢測；2．用紫外分光光度計(jì)測量 DNA 濃度3. 將 DNA 調(diào)節(jié)濃度至 3004500 ng/181。實(shí)驗(yàn)原理：參見系列一中實(shí)驗(yàn)二；限制性內(nèi)切酶的特點(diǎn)：見“基因操作原理” 。g/ml 的 RNaseA） ，置于 4℃過夜，待 DNA溶解后，檢測 DNA 濃度及質(zhì)量。加入 50181。12022 rpm 離心 10min，吸去上清，用加 500181。l 上清于一新 離心管，加入 1ml 95%乙醇或無水乙醇和 45181。12022rpm 離心 5 分鐘。l 轉(zhuǎn)至一新 離心管，加入等體積（600181。12022rpm 離心 5 分鐘。預(yù)熱 CTAB 到 95℃，加 1ml 到裝有葉片粉末的離心管中，快速上下顛倒數(shù)次混勻（注意：防止凍融） 。再經(jīng)過氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質(zhì)、多糖、色素等來純化DNA，最后經(jīng)異丙醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來。CTAB 與核酸形成復(fù)合物，此復(fù)合物在高鹽（）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（ NaCl）下 CTAB核酸復(fù)合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質(zhì)及多糖等仍溶解于溶液中。實(shí)驗(yàn)材料及試劑：水稻葉片，CTAB，氯仿/異戊醇(24:1)，95%乙醇或無水乙醇等實(shí)驗(yàn)原理：植物 DNA 的抽提常采用兩種方法：（1）SDS 法： 離子去污劑，過程長，純度高；（2）CTAB 法：該方法簡便、快速，DNA 產(chǎn)量高( 純度稍次，適用于一般分20子生物學(xué)操作)。其特點(diǎn)：1) 可以標(biāo)記 DNA、RNA 或 Oligonucleotides2) 靈敏度高3) 結(jié)果顯示所需時(shí)間短，無需幾小時(shí)甚至幾天的自顯影過程；4) 安全環(huán)保，不接觸放射性物質(zhì)，不會(huì)對(duì)環(huán)境造成污染；5) 探針可重復(fù)使用，最少可以穩(wěn)定儲(chǔ)存一年；6) 可輕松進(jìn)行探針撥離和重探實(shí)驗(yàn)材料及試劑：水稻葉片，液氮，CTAB，氯仿/異戊醇(24:1)，95%乙醇或無水乙醇等HindIII, 瓊脂糖，尼龍膜，