【正文】 7. 清潔操作區(qū)域。5. 對需要行輔助孵化的所有胚胎完成削薄操作。選擇卵周隙較大的位置對透明帶進(jìn)行削薄操作，以免激光的熱效應(yīng)影響透明帶下的卵裂球。2. 把裝有胚胎的培養(yǎng)皿放在倒置顯微鏡載物臺上，將焦距調(diào)節(jié)清晰。同時此類助孕者的胚胎質(zhì)量往往不如年輕者；2. IVF治療史：有IVF治療失敗史，在排除子宮內(nèi)膜，胚胎質(zhì)量等明顯影響其植入的因素后，在再次IVF時應(yīng)做輔助孵化，因?yàn)槟遗卟荒芊醭隹赡苁侵踩胧〉脑颍?. 透明帶異常：當(dāng)出現(xiàn)胚胎透明帶異常，如形態(tài)不規(guī)則，呈橢圓形，或透明帶著色深，或透明帶厚度增厚（≥15mm），均提示透明帶異常，或有某種功能上的缺陷需做輔助孵化；4. 胚胎碎片率＞20％：在沒有優(yōu)質(zhì)胚胎可供選擇的前提下，當(dāng)胚胎出現(xiàn)較多碎片時，通過輔助孵化使碎片流出，可能有助于胚胎發(fā)育和孵化；5. 基礎(chǔ)FSH升高（≥15mIU/ml）：FSH基礎(chǔ)水平升高常提示卵巢功能較差，卵子的透明帶可能出現(xiàn)異常；6. 胚胎或卵子冷凍復(fù)蘇后。本中心使用非接觸性激光對透明帶進(jìn)行局部削薄，而不影響透明帶內(nèi)層的完整性。11. 完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室記錄。9. 將洗滌后的胚胎轉(zhuǎn)入另一囊胚培養(yǎng)液滴中培養(yǎng)，在皿蓋上標(biāo)記患者姓名，另一實(shí)驗(yàn)室人員核對，顯微鏡下觀察后放回培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)。7. 將胚胎移入WSWS2各放置5分鐘（室溫）。5. 用準(zhǔn)備好的巴氏德吸管將胚胎轉(zhuǎn)移至DS液中（室溫），停留3分鐘，在此期間將胚胎移動1~3次。（注意：TS液必須先預(yù)熱至37℃）3. 在液氮中將冷凍載桿從套管中取出。1. 培養(yǎng)液準(zhǔn)備：冷凍胚胎復(fù)蘇的前一日，用囊胚培養(yǎng)液準(zhǔn)備胚胎培養(yǎng)皿，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)平衡過夜。11. 完成相應(yīng)的實(shí)驗(yàn)室記錄。9. 在液氮中，將載桿尖細(xì)端套入套管中，并裝入冷凍支架內(nèi)迅速將其投入液氮罐中保存。8. 將胚胎裝入冷凍載體上，插入液氮中時應(yīng)輕晃一下，這樣可以使胚胎加速降溫。在此過程中，胚胎會出現(xiàn)皺縮并隨即膨脹，當(dāng)其復(fù)膨到最大程度（至少80%）時，即達(dá)到平衡狀態(tài)，此時迅速將胚胎移入VS孔中（注意：400ml微滴可在等待胚胎平衡時制作）。注意以下操作均為室溫下進(jìn)行。5. 液氮準(zhǔn)備：準(zhǔn)備一個小液氮容器，裝滿液氮，并準(zhǔn)備兩根長鑷子。4. 標(biāo)記：準(zhǔn)備載體、剪刀、標(biāo)簽。2. 取1個四孔板，在蓋子上標(biāo)記ES、VS液，每孔各加400ml。八、 胚胎的玻璃化冷凍以下操作流程為卵裂期胚胎為例，卵子與囊胚的玻璃化冷凍操作可參考此流程。遲于D7上午形成囊胚者不再繼續(xù)培養(yǎng)。6. D5檢查囊胚形成率并進(jìn)行評分，選擇可供移植或冷凍的胚胎。將裝入胚胎的培養(yǎng)皿放入37℃、6% CO2培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。3. 拉針：取一根巴斯德吸管煅燒拉細(xì)成微吸管。七、 囊胚培養(yǎng)1. 囊胚培養(yǎng)皿準(zhǔn)備：受精后第2天準(zhǔn)備囊胚培養(yǎng)皿，使用G2 Plus在培養(yǎng)皿（Falcon300l）中制作10個微滴，每個微滴25ml，蓋礦物油3ml。4. 注意事項（1） 如果在移植過程出現(xiàn)困難移植導(dǎo)致時間過長，需將胚胎重新放回移植皿中，直至臨床醫(yī)生確認(rèn)能夠安全的將胚胎移入子宮后再行移植。如果有胚胎殘留，必須用一根干凈的移植管重新裝入，重新移植。（3） 將裝好胚胎的移植管平穩(wěn)的拿到臨床手術(shù)室，再次核對患者夫婦姓名，確認(rèn)無誤后緩慢的插入外管內(nèi)， cm處，調(diào)整好后，緩慢平穩(wěn)的推動注射器，將內(nèi)管內(nèi)胚胎及移植液注入患者子宮，注射器推至末端，停留30秒后退出內(nèi)外管。3. ET操作步驟（1） 核對好患者姓名，將待移植胚胎轉(zhuǎn)入已準(zhǔn)備好的ET皿中。在D56，選擇囊腔擴(kuò)張充滿，內(nèi)細(xì)胞團(tuán)致密、細(xì)胞數(shù)多，滋養(yǎng)層細(xì)胞數(shù)目多的胚胎。（3） 采用連續(xù)評分法挑選，即綜合原核評分和胚胎形態(tài)評分，挑選形原核評分高、形態(tài)好、碎片少、無空泡的優(yōu)質(zhì)胚胎進(jìn)行移植。（2） 胚胎移植后若有剩余胚胎，應(yīng)征求患者對剩余胚胎的處理意見并簽署《配子與胚胎去向知情同意書》。2. 選擇移植胚胎的原則（1） 移植胚胎的數(shù)量嚴(yán)格執(zhí)行衛(wèi)生部規(guī)定，35歲以下患者不超過2個，35歲及以上患者以及多次IVF失敗的患者可以一次移植3個胚胎。將移植液根據(jù)每例移植500ml的量加入Falcon 2001圓底試管中，置37℃、6% CO2培養(yǎng)箱內(nèi)過夜平衡。 20％，大小比較均勻；4. Day56（授精后112140小時）：3BB及以上。（七） 優(yōu)質(zhì)胚胎定義1. Day1為2pn；2. Day2（授精后4044小時）：2－5細(xì)胞，碎片163。在實(shí)驗(yàn)室記錄上記錄每個胚胎的情況。2. 36期囊胚再評估項目內(nèi)細(xì)胞團(tuán)：A：包裹緊密，大量細(xì)胞B：結(jié)構(gòu)松散，少量細(xì)胞C：極少量細(xì)胞滋養(yǎng)外胚層：A：許多細(xì)胞形成緊密結(jié)合的上皮B：少量細(xì)胞形成結(jié)構(gòu)松散的上皮C：極少量細(xì)胞（五） 解凍胚胎的評分1. 解凍后所有卵裂球存活的胚胎，按新鮮胚胎的評分標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分； 2. 解凍后如有卵裂球死亡，則僅記錄存活的卵裂球數(shù)，不再進(jìn)行評分；3. 凍融胚胎一半以上卵裂球存活，胚胎可判斷為存活，可用于移植。5期：正在孵出囊胚，滋養(yǎng)外胚層通過透明帶向外凸出。3期：擴(kuò)張囊胚，囊胚腔完全占據(jù)胚胎的總體積。（四） 囊胚的評分1. 分期1期：早期囊胚，囊胚腔不到整個胚胎的1/2。III級：細(xì)胞大小明顯不均勻，可有形狀的明顯不規(guī)則；胞質(zhì)可有明顯顆?，F(xiàn)象；碎片在21－50％之間。（三） 卵裂期胚胎評分I級：細(xì)胞大小均勻，形狀規(guī)則；胞質(zhì)均勻清晰，沒有顆?，F(xiàn)象；碎片在0－5％之間。3. 原核的出現(xiàn)和消失是一個動態(tài)過程，不同的時間評估可能會有不同的結(jié)果。Z1級：每個原核核仁數(shù)37個，核仁在原核相交處排列成線；Z2級：原核大小相等，但核仁不成線排列在原核相交處；Z3級：兩原核特征不同，核仁的大小、數(shù)目不等，不排列在原核相接處；Z4級：原核大小明顯不等，原核相離。（二） 受精卵評分1. 正常受精卵（2PN）：表現(xiàn)為胞質(zhì)內(nèi)有兩個原核，可見第二極體。C：無彈性。B：破膜困難。3. ICSI破膜方式A：破膜順利。在此階段的卵子中既看不到細(xì)胞核也看不到第一極體。此時胞漿中看不到細(xì)胞核的結(jié)構(gòu)，在卵黃間隙中可見第一極體。卵細(xì)胞顏色變深，放射冠分散，但外周的卵丘細(xì)胞團(tuán)很小或缺失。卵細(xì)胞外觀顏色偏深，形態(tài)為規(guī)則的圓形，放射冠呈完全分散狀，卵丘細(xì)胞團(tuán)通常較大，排列松散，顏色很淡。卵細(xì)胞外觀顏色較深，放射冠已呈不同程度的分散，卵丘細(xì)胞排列變稀松，顏色變淺。卵細(xì)胞呈淺透明狀，放射冠完全沒有分開，卵丘細(xì)胞緊密排列，顏色偏淺或卵丘細(xì)胞團(tuán)很小。（6） ICSI操作時動作要輕柔快速，從制動精子至精子被注入一枚卵子胞質(zhì)中的時間宜控制在3分鐘內(nèi)。（4） 用注射針制動精子要避開其頸部。（2） ICSI操作皿制備要快速，同一時間只能準(zhǔn)備1個皿，要避免微滴蒸發(fā)脫水，臨近ICSI操作時準(zhǔn)備。14. 重復(fù)上述步驟至所有的成熟卵子都注射完畢，將ICSI皿從顯微鏡熱板轉(zhuǎn)移至解剖鏡下，從培養(yǎng)箱取出卵裂培養(yǎng)皿，每個卵子在培養(yǎng)皿中央兩個液滴中漂洗數(shù)次，再轉(zhuǎn)移至旁邊微滴中放回培養(yǎng)箱。調(diào)節(jié)顯微操作針和卵膜至同一水平面，將精子推至注射針尖處，于3點(diǎn)鐘處垂直穿過透明帶并繼續(xù)進(jìn)針，至卵中心或越過中心位置（卵母細(xì)胞直徑的5075%），輕微回吸注射針，當(dāng)胞漿和精子出現(xiàn)快速返流的過程，指示卵膜已破，停止回吸，將精子緩慢注入卵子胞質(zhì)內(nèi)，緩慢退出注射針。將精子先尾后頭吸入注射針內(nèi)，然后將注射針轉(zhuǎn)入卵子的GMOPSTM Plus微滴中。12. 精子制動：將注射針移入含有精子的條形PVP液滴中，在微滴上端選擇形態(tài)、活力正常的精子吸入注射針，轉(zhuǎn)入另一PVP微滴，將精子放置于操作皿底部。將盛有卵子的操作皿放置于調(diào)好的顯微鏡操作儀的熱臺上；10物鏡下調(diào)節(jié)顯微鏡焦距使操作皿內(nèi)微滴的邊緣清晰可見。10. 將持卵針和注射針升高，確保操作臺與熱臺之間的高度能夠輕松放置操作皿而不碰及操作針。安裝持卵針和注射針時，應(yīng)避免注射針管道系統(tǒng)中有氣泡。在雙人核對下，在橢圓的PVP邊緣加入微量處理過的精子，覆蓋已平衡過的礦物油，置37℃培養(yǎng)箱內(nèi)備用。8. 準(zhǔn)備ICSI操作皿（Falcon 1006）：在皿底和皿蓋標(biāo)記好患者姓名。6. 用原口徑巴斯德吸管將不多于8個OCCC移入含透明質(zhì)酸酶的孔中沖洗吸打3060秒，至外層顆粒細(xì)胞脫去后，用稍粗口徑吸管將卵子移入GMOPS Plus中。再取3根巴期德吸管煅燒拉細(xì)成微吸管，2根稍粗，口徑約為200mm；第3根稍細(xì)，口徑約為140mm。準(zhǔn)備一個四孔皿，其余三孔加入平衡好的GMOPS Plus各1ml，在37℃培養(yǎng)箱孵育15分鐘。3. 提前30分鐘打開恒溫操作臺，將圓底加熱試管架放置于臺面同時加熱，使溫度穩(wěn)定在37℃左右。取卵前一天下午根據(jù)卵泡數(shù)量準(zhǔn)備剝卵用培養(yǎng)液GMOPS Plus，加入Falcon 2001圓底試管中，蓋緊蓋子，放在37℃培養(yǎng)箱內(nèi)平衡。 PESA/TESA獲得的精子； 常規(guī)IVF受精失敗（成熟卵子受精率低于30%）。7. 受精觀察：將裝有受精卵的培養(yǎng)皿放在倒置顯微鏡下，觀察原核。6. 從培養(yǎng)箱內(nèi)取出準(zhǔn)備好的卵裂培養(yǎng)液微滴的皿，標(biāo)記患者姓名和皿號，和另一個工作人員核對無誤。4. 用稍粗的巴斯德吸管將卵子轉(zhuǎn)移到剝卵皿液滴，再用稍細(xì)的巴斯德吸管吹吸受精卵數(shù)次，盡量除去顆粒細(xì)胞直至可清晰觀察受精卵。3. 脫顆粒針的拉制：取兩根巴期德吸