【正文】 【方法】 無菌蓋玻片及載玻片置于無菌空平皿內(nèi)，滴加溶化的玉米吐溫 80 瓊脂 1 滴于蓋玻片上，凝固后，用接種針將待鑒定菌從緊貼蓋玻片處穿刺接種到培養(yǎng)基，用鑷子將蓋玻片翻轉(zhuǎn)，有培養(yǎng)基的面貼在載玻片上。 厚壁孢子形成試驗(yàn) 【原理】 在 25℃溫度下，白色念珠菌可在玉米吐溫 80 瓊脂培養(yǎng)基上形成頂端厚壁孢 第 40 頁 共 111 頁 子，其它念珠菌不能形成。 【臨床意義】 該 法是快速鑒別白色念珠菌的常用方法之一。 【注意事項(xiàng)】 1．血清應(yīng)新鮮。 【方法】 加 血清于無菌試管中，接種少量念珠菌培養(yǎng)物，混勻后置 37℃孵育，每 1h 用接種環(huán)取 1 滴培養(yǎng)物鏡檢，共 3 次。 念珠 菌的鑒定試驗(yàn) 芽管試驗(yàn) 【原理】 白色念珠菌在血清中形成芽管，而其它念珠菌不能形成。 【臨床意義】 培養(yǎng)結(jié)果陽性，可見念珠菌，可確診念珠菌感染，尤其對于男性念珠菌性前列腺炎，龜頭炎等。 【注意事項(xiàng)】 第 39 頁 共 111 頁 念珠菌和酵母菌同時(shí)可在 GC 或 TM 培養(yǎng)基上生長，但生長較慢，菌落小，呈灰白色。 【結(jié)果】 24h 培養(yǎng)后，念珠菌菌落為奶油色、閃光、軟而平滑。觀察菌落。將分泌物標(biāo)本用棉拭子采集后直接涂在培養(yǎng)基表面， 24~48h 生長出較大的乳白色菌落。但陰性時(shí)不能完全排除感染，僅憑鏡檢也不能確定為何種念珠菌感染，需作念珠菌培養(yǎng)鑒定。 【臨床意義】 涂片顯微鏡檢查的陽性率較其他方法高，但只要檢查陽性，即可確診。 【結(jié)果】 經(jīng)革蘭染色后假菌絲及芽生孢子或孢子均被染成革蘭陽性 (紫色 )，假菌絲的狹窄部及孢子芽生的特征明顯，易于觀察。 2． 涂片：將所采集標(biāo)本加少量鹽水制成薄片，室溫自然干燥。 干片革蘭染色法 【原理】 分泌物涂片染色后，念珠菌的假菌絲及芽生孢子可染成革蘭陽性，更利于檢出，同時(shí)還可以觀察有無其他微生物及細(xì)胞組織。 (2)念珠菌性陰道炎、龜頭炎的病人，僅有分泌物或偽膜而無鱗屑的病人，可直接用等滲鹽水涂片作檢查，這樣可以直接用玻片上的標(biāo)本做真菌培養(yǎng)。皮屑直接鏡檢可見菌絲和孢子，報(bào)告時(shí)應(yīng)寫 為“菌絲、孢子陽性”。結(jié)果報(bào)告為“假菌絲及芽生孢子陽性 ” 。m 。 3．試劑：復(fù)方 KOH(10%) KOH 10g 二甲基亞砜 40m1 甘油 20m1 蒸餾水 加至 100ml 第 37 頁 共 111 頁 【方法】 加 1 滴 10%KOH 于載玻片上，將采集標(biāo)本直接涂在 KOH 溶液中，蓋上蓋玻片，置酒精燈火焰微加熱，直接 10 或 40 鏡檢。 ④龜頭皮屑：鈍刀刮取皮屑或濕棉拭子用力擦拭。 ②尿液：收集清晨新鮮中段尿 10~ 20m1，以 2020r/min 離心 15min 后，取沉渣涂片。 男性：用滅菌鈍刀蘸取少量滅菌生理鹽水，刮取龜頭或陰莖包皮，取分泌物及皮屑。 【材料】 1．標(biāo)本的采集： ①分泌物： 女性：用滅菌棉拭子從陰道后穹隆處取分泌物。對于癥狀不典型的女性病人和男性念珠菌感染往往需要實(shí)驗(yàn)室診斷。 第 36 頁 共 111 頁 第 六 章 念珠菌實(shí) 驗(yàn)室檢測 念珠菌屬陰道內(nèi)正常菌群，絕大多數(shù)女性表現(xiàn)為無癥狀帶菌，部分可發(fā)展成為有癥狀的疾病。 3．觀察時(shí)間一般 48h，以對照為準(zhǔn)。 【注意事項(xiàng)】 1．用于試驗(yàn)的藥物不應(yīng)含有賦形劑，要求純度要高，需用精密天平稱取。在管底下吸取培養(yǎng)液一滴置玻片在顯微鏡下觀察。 2．取一定量的滴蟲懸液，加滴蟲懸液于各管內(nèi)，每管 ，混勻。 【試劑】 1． Diamonds 培養(yǎng)基 2． 抗菌素 【 方法】 1．排列試管 10~15 支，每管加入 Diamond：培養(yǎng)基 3ml，自第二管起將藥物原液加入 試管中作系列倍比稀釋，濃度應(yīng)適合當(dāng)?shù)氐哪退幩健? 第 35 頁 共 111 頁 【臨床意義】 臨床標(biāo)本中由于滴蟲的數(shù)量少，一般常規(guī)涂片染色檢查不易檢出，通過培養(yǎng)的方法可使蟲體增殖，數(shù)量增多，提高檢出率，多應(yīng)用于在科研或藥敏篩查。至少可存活 24h以上。 6．一般情況，標(biāo)本采集后應(yīng)立即送檢。 5．為了獲得供實(shí)驗(yàn)用的滴蟲蟲株，臨床分離的蟲株需傳代保存。有時(shí)雖經(jīng)培養(yǎng)但蟲體仍較少時(shí)，則需將培養(yǎng)物離心取沉渣作涂 片檢查。但因操作較麻煩，不作為常規(guī)檢查，主要用來檢查輕癥病人，帶蟲者，慢性患者和科研需要作診斷和療效觀察的依據(jù)。 【注意事項(xiàng)】 1．培養(yǎng)法是檢查陰道毛滴蟲最為敏感的方法，常用于無癥狀感染 (主 要指滴蟲數(shù)量少 )，或有癥狀但涂片檢查為陰性者以及男性滴蟲病的診斷，同時(shí)也可用于尋找敏感藥物以及藥物治療效果的動(dòng)態(tài)觀察等。培養(yǎng)步驟：將所取標(biāo)本直接放入培養(yǎng)基中，置 37℃溫箱培養(yǎng) 48h，用無菌滴管伸入管底吸取 培養(yǎng)物作懸滴法或染色法檢查，如為陰性，應(yīng)繼續(xù)培養(yǎng)至 6~7 天檢查一次，必要時(shí)離心取沉渣檢查。 【方法】 培養(yǎng)陰道 毛滴蟲的最適溫度為 37℃，最適 ~。培養(yǎng)基中加入抗生素是為了殺滅其他微生物以獲得較為純凈的滴蟲。由于滴蟲對培養(yǎng)的要求不太高，因此一般供培養(yǎng)原蟲的培養(yǎng)基也可用于滴蟲的培養(yǎng)，但在任何培養(yǎng)基內(nèi)均需加入血清，因?yàn)檠逯泻械蜗x生長所必需的生長因子。有利于鑒定，并可長時(shí)間保存和利于教學(xué)。 2．涂片過程、染色過程的擠壓等閑素，可造成蟲體大小懸殊，形態(tài)多形性， 但是長圓形的細(xì)胞核，疏松且有空泡的細(xì)胞質(zhì)，及偶可見到的 4 根前鞭毛具有一定的特征性，不難辨認(rèn)。 【結(jié)果】 革蘭染色時(shí)，滴蟲易受涂片時(shí)的擠壓變形，可呈多形性，如梨性、圓形、長 第 33 頁 共 111 頁 圓形、多角形等；大小差異較大，介于白細(xì)胞的 2~3 倍至鱗狀上皮細(xì)胞的 1/2 之間；蟲體輪廓清楚，胞漿稍呈嗜酸性，疏松泡沫狀，有紫紅色長圓形細(xì)胞核，多在偏心位置，并偶見 1~4 條鞭毛，而滴蟲的波動(dòng)膜及軸柱難于著色，不易見。 2．固定： 用酒精燈火焰固定或甲醇固定。 涂片染色法 【原理】 分泌物涂片作染色檢查，可以清楚地看到蟲體形態(tài)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)，還能觀察到陰道的微生物相、清潔度和細(xì)胞組織相。 【臨床意義】 滴蟲檢查陽性，結(jié)合臨床表現(xiàn)，即可做出初步診斷，應(yīng)及時(shí)治療。 2．從取 材到觀察的時(shí)間間隔越短越好，否則易影響滴蟲的活動(dòng)性或蟲體受到破壞使檢查結(jié)果受到影響。有時(shí)亦可見到保護(hù)形的滋養(yǎng)體，其形態(tài)為外圍細(xì)胞質(zhì)增厚，細(xì)胞質(zhì)呈均勻，光潤，透明。m ，稍大于白細(xì)胞。 【結(jié)果】 等滲鹽水濕片中若有陰道毛滴蟲，則鏡下可見梨形或水滴狀，無色透明或淡 第 32 頁 共 111 頁 藍(lán)綠色蟲體，大小約 10~30181。尿液 需 2020r/min 離心15min，離心后取沉渣一滴于載玻片上。 2．用具：棉拭子、載玻片、蓋玻片、窺陰器、滅菌鹽水、酒精燈。 ②尿液：收集清晨首次尿或憋 4h 后的首次尿的前段尿 10~20ml 送檢。 【 材料 】 1．標(biāo)本采集： ①分泌物： 女性取材：用無菌棉拭子從陰道后穹隆處取泡沫樣分泌物。等滲鹽水可保持陰道毛滴蟲維持寄生于宿主時(shí)的形態(tài)和運(yùn)動(dòng)狀態(tài)。常常要求通過實(shí)驗(yàn)室檢查來確診。 第 31 頁 共 111 頁 第五章 陰道毛滴蟲實(shí)驗(yàn)室檢測 陰道毛滴蟲陰道感染，可引起各種陰道炎或無癥狀的攜帶者。然而還不清楚此菌是否真的能寄生在男性體內(nèi)，抑或只是從女性性伴那里獲得。 BV 患者的陰道加特納氏菌的數(shù)量增加，在此病人陰道中 100%能分離到加特納菌，本菌還能引起新生兒致死性和非致死性敗血癥和軟組織感染，亦可從陰道膿腫、前庭大腺炎、腹水和咽喉部分離出來。 【結(jié)果】 5%二氧化碳條件下培養(yǎng) 48h，陰道加特納菌表現(xiàn)為直徑 ，圓形、透明至白色，周圍有一圈彌散的β 溶血環(huán)，涂片革蘭染 色，可見多形性的革蘭染色不穩(wěn)定的球桿菌或陰性短小桿菌，則可初步鑒定為陰道加特納菌，氧化酶和觸酶均陰性，應(yīng)進(jìn)行糖發(fā)酵確定試驗(yàn)。 【 方法 】 取陰道分泌物接種于改良人血雙層吐溫瓊脂 (HDT)。在人血瓊脂平板上，經(jīng) 35℃于含 5%二氧化碳環(huán)境中培養(yǎng) 48h，可形成 ～ ，β 溶血、圓形、光滑、不透明的菌落。革蘭染色鏡檢觀察陰道上皮細(xì)胞中線索細(xì)胞的敏感性和特異性高于濕片法，分別為 89%利 93%。 【臨床意義】 當(dāng)線索細(xì)胞占全部上皮細(xì)胞的 20%以上時(shí)一般認(rèn)為可診斷 BV。 2．干片法：取陰道分泌物，涂片，作革蘭染色，油鏡 (1000 倍 )下檢查。對陰道分泌物作濕片和涂片革蘭染色，在顯微鏡下可觀察線索細(xì)胞的有無和百分比多少，以及陰道菌群的變化情況。 線索細(xì)胞檢查一濕片法 /干片法 【原理】 細(xì)菌性陰道病時(shí)陰道正常菌群發(fā)生變化，乳桿菌減少或消失，而陰道加特納菌、厭氧菌等過度生長。 【臨床意義】 指導(dǎo)臨床用 藥及支原體耐藥性監(jiān)測。 【注意事項(xiàng)】 1．試驗(yàn)藥物應(yīng)為純粉，藥物濃度要準(zhǔn)確。 【結(jié)果】 試驗(yàn)條鑒定孔中 Uu或 Mh培養(yǎng)孔變?yōu)榧t色，清亮透明為陽性。 4．蓋好蓋子，于 37℃培養(yǎng)，每天觀察各孔顏色變化。 2．將拭子標(biāo)本放于保存液中，擠壓棉拭子將標(biāo)本洗到保存液中，把保存液加入凍干的培養(yǎng)基 瓶中，充分溶解混勻。 女性標(biāo)本：將宮頸口粘液抹去，用無菌拭子插入宮頸管內(nèi) 1～ 2cm旋轉(zhuǎn)取材。 【材料】 試劑：上述普通液體培養(yǎng)基加入不同濃度抗生素。純培養(yǎng)物可用于其他生化鑒定和分子流行病學(xué)研究，可進(jìn)行菌株的保存。 2．如無生長，應(yīng)連續(xù)觀察 5 天，并區(qū)別其他污染菌。 2． A7 鑒別培養(yǎng)基上，菌落形態(tài)同上但 Uu 菌落呈黑色， Mh 菌落基本無色。m ，周邊較窄； Mh 菌 第 27 頁 共 111 頁 落較大，直徑約 300～ 800181。 A7 鑒別培養(yǎng)基直接低倍觀察。 2．標(biāo)本直接接種：將標(biāo)本直接接種于固體培養(yǎng)基，置于 37℃含有 5%～ 10%CO2燭缸培養(yǎng) l～ 5 天。 2．分離鑒定培養(yǎng)基： A7 鑒別培養(yǎng)基 (配 制見附錄 1)。通過其獨(dú)特的菌落形態(tài)可進(jìn)一步鑒定。 【臨床意義】 支原體培養(yǎng)陽性，說明有支原體感染，如果患者有臨床癥狀，但其它的病原體檢查陰性，則應(yīng)考慮支原體引起致病的可能，在部份正常人群中也可以存在支原體。 2．取材后應(yīng)盡快接種， 如果有能及時(shí)接種，應(yīng)將標(biāo)本放入 1ml 運(yùn)送保存液中冰箱保存， 4℃ 易失去活力，超過 48h 應(yīng)放 70℃冰箱保存。 【結(jié)果】 液體培養(yǎng)基由黃色變紅色，清亮透明無混濁可初步判斷為 Uu 或 Mh 陽性。 2．接種：將標(biāo)本 洗入單一 Uu 或 Mh 液體培養(yǎng)基，或用濾菌器過濾接種。 女性標(biāo)本：將宮頸口粘液抹去，用無菌拭子插入宮頸管內(nèi) l~2cm旋轉(zhuǎn)取材。 人型支原體 (Mh)只有精氨酸酶，能分解精氨酸產(chǎn)氨，使含酚紅指示劑的 Mh液體培養(yǎng)基 pH 值升高，液體顏色由黃變紅。由于相當(dāng)部分正常性活躍人群生殖道中可查到支原體，因此對試驗(yàn)結(jié)果的解釋應(yīng)慎重。 第 25 頁 共 111 頁 第三章 支原體實(shí)驗(yàn)室檢測 支原體生殖道感染與非淋菌性尿道炎或?qū)m頸炎有關(guān)，此外可引起前腺炎、附睪炎、輸卵管炎、流產(chǎn)、死產(chǎn)和不育癥等。 第 24 頁 共 111 頁 【臨床意義】 深部衣原體感染，如 LGV、副睪炎、女性盆腔炎或其他感染等，衣原體 IgG試驗(yàn) 陽性。 4． IgC 抗體測定不能取代衣原體培養(yǎng)法，不能完全依賴于該結(jié)果診斷衣原體的感染。 2． 所有病人的標(biāo)本利各試劑均按可能含有傳染性對待。 3． c