【正文】 第 1 頁 共 111 頁 第一章 淋病的實驗 淋病 (gonorrhea)是指由淋病奈瑟菌引起的泌尿生殖道的化膿性感染，如尿道炎、宮頸炎和直腸炎等。如不及時治療，淋球菌可侵入泌尿生殖器的其他部位，引起附睪、前列腺、輸卵管及盆腔等器官的炎癥，甚至可經(jīng)血液傳播到全身其他部位，形成淋菌性關(guān)節(jié)炎、腱鞘炎、心內(nèi)膜炎、腦膜炎等合并癥。但另一方面，也有 5%20%的男性和 60%的女性病人呈現(xiàn)無癥狀經(jīng)過。淋球菌好侵犯人類泌尿生殖道的柱狀上皮細(xì)胞，憑借特異的結(jié)構(gòu)和粘膜表面與之相匹配的部位粘附。繼而侵入細(xì)胞內(nèi)增殖，使粘膜上皮破壞，形成炎癥，出現(xiàn)一系列癥狀 。 一、淋病診斷步驟 人類尿道上皮尤其是柱狀上皮細(xì)胞對淋球菌相當(dāng)敏感。在感染淋球菌后，經(jīng)過一段時間的潛伏期 (平均 3 天 ~5 天 )。由于細(xì)菌和毒素的作用，粘膜壞死、脫落、神經(jīng)末梢暴露、炎癥浸潤、組織液滲出，病人會出現(xiàn)尿急、尿痛和尿道流膿等急性尿道炎癥狀。 淋球菌感染男性病人，常會出現(xiàn)尿痛和尿道流膿等臨床癥狀。這時取尿道分泌物作涂片，經(jīng)革蘭染色后，如見到有符合淋球菌形態(tài)特征的革蘭陰性細(xì)胞內(nèi)雙球菌，則初步診斷陽性，可對病人進(jìn)行治療；如涂片查菌陰性，應(yīng)從尿道取標(biāo)本進(jìn)行淋球菌培養(yǎng)。淋球菌感染的女病人，常僅 有膿性宮頸分泌物或無癥狀。對女病人不推薦用涂片法檢查，而主張直接從宮頸取材進(jìn)行培養(yǎng)。標(biāo)本經(jīng)培養(yǎng)后，菌落形態(tài)典型、氧化酶試驗陽性，菌體為革蘭陰性雙球菌，則初步診斷為陽性培養(yǎng)物，如有某些性狀不符合，則可進(jìn)一步用糖發(fā)酵試驗及直接免疫熒光法等作鑒定加以確診。 二、標(biāo)本的采集和運送 在取材作涂片時，應(yīng)先用滅菌等滲鹽水洗凈尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，用棉拭或白金耳蘸取膿液后輕輕涂布于載玻片上。待自然干燥后作染色。 第 2 頁 共 111 頁 如由男性病人前尿道取材作培養(yǎng)時，應(yīng)用白金耳或藻酸鈣拭子深入尿道2cm~4cm，取出的分泌物應(yīng) 略帶粘膜。從女病人的宮頸取材時，應(yīng)將棉拭插入宮頸口 ，稍轉(zhuǎn)動并停留 10s~30s，讓棉拭充分吸附分泌物。從肛門取材時，應(yīng)將棉拭插入肛門 ，從緊靠肛環(huán)邊的隱窩中取材。檢查淋菌性咽炎時從扁桃體或扁桃體窩或咽后壁取材。 淋球菌對外環(huán)境因素如干燥抵抗力很弱。因此，為了保證培養(yǎng)成功，應(yīng)盡量縮短標(biāo)本離體時間。在醫(yī)院門診部，從病人取材后，應(yīng)立即接種到培養(yǎng)基上進(jìn)行培養(yǎng)。如取材本處離實驗室較遠(yuǎn)時，可將標(biāo)本置于無營養(yǎng)性的 Stuart 或 Amies運送培養(yǎng)基或選擇性生長培養(yǎng)墓如 Trmlsgrow 中運送到實驗室。 標(biāo)本在無營養(yǎng)運送培養(yǎng)中 (在室溫 25℃ 條件下 )， 12h 對分離率無影響，在 24h 內(nèi)分離大于 90%。如需時再應(yīng)使用生長運送培養(yǎng)基，但即便如此，也不應(yīng)超過 2 天。 淋病的涂片檢查 【 原理 】 急性淋菌性尿道炎病人常有大量黃色膿性分泌物。在有些膿細(xì)胞內(nèi)可有許多淋球菌。淋球菌革蘭染色呈陰性反應(yīng)，具有特殊的菌體形態(tài)。因此，取病人尿道分泌物制成涂片后做革蘭染色，檢查有無典型細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌，可作初步診斷的依據(jù)。 【方法】 1．先用滅菌等滲鹽水的拭子揩洗尿道口，然后用手指由后向前擠出膿液，蘸取膿液后輕輕涂布于載玻 片上。待自然干燥后加熱固定，染色，鏡檢。常用革蘭染色，也可用美藍(lán)染色。 2．涂片后，待自然干燥后火焰固定， 革蘭氏染色：結(jié)晶紫染色 1min。 碘媒染液染色 1min。 乙醇丙酮脫色 1min 左右。 第 3 頁 共 111 頁 石炭酸復(fù)紅復(fù)染 1min。 晾干后油鏡鏡檢。 【結(jié)果】 在急性病人的尿道膿性分泌物革蘭染色涂片中，?？梢姷酱罅考t色多形核白細(xì)胞。在有些細(xì)胞中吞噬有淋球菌。淋球菌為革蘭陰性，呈卵圓形或圓形，常成對排列，接觸面扁平或稍凹。菌體長約 ，寬約 。但兩菌大小可有差異。 多數(shù)多形核細(xì)胞中并不含淋菌，但不少膿細(xì)胞中常含有 一 至數(shù)對，甚至 20對 30 對淋球菌，淋球菌常存在于細(xì)胞漿內(nèi)。 在病期較長的淋病病人的涂片中淋球菌比較少，有時呈單個、四聯(lián)和八疊狀，位于細(xì)胞外。對有些菌有時難以下結(jié)論，需進(jìn)行培養(yǎng)和鑒定。 【注意事項】 1．涂片時不要用力涂擦，而應(yīng)將棉拭在玻片上輕輕滾動，因急性病人診斷標(biāo)準(zhǔn)為見到“細(xì)胞內(nèi)革蘭陰性雙球菌”。涂擦過勁，細(xì)胞破裂或變形，菌從細(xì)胞內(nèi)逸出，會造成診斷上的混淆。 2．涂片厚薄要合適。涂片過厚，加之染色過程中脫色時間不足，革蘭陰性菌也會呈現(xiàn)紫色。因此，脫色 時間要視涂片厚薄而定。在大量染片時，最好用一已知的革蘭陽性菌 (如葡萄球菌 )和陰性菌 (如大腸桿菌 )作對照。 3．固定涂片，只要將涂片迅速通過火焰 2~3 次，避免加熱過度使細(xì)胞變形扭曲。當(dāng)把加熱的涂片放到手背上時應(yīng)不感到太燙。 4．不推薦用涂片檢查來診斷淋菌性直腸和咽部的感染，也不推薦用作判愈。 【臨床意義】 涂片檢查方法簡便、有效、價格低廉且有一定的敏感性和特異性。但其特異性隨著取材部位的不同而有所不同。例如，從男性尿道取材特異性高，而從女性宮頸取材特異性低。因女性宮頸分泌物中雜菌很多，有的在形態(tài)上很像 淋球菌。因此，世界衛(wèi)生組織不推薦用涂片法來檢查女性病人。 第 4 頁 共 111 頁 淋球菌的分離培養(yǎng) 【原理】 如果標(biāo)本中有淋球菌，則在合適的培養(yǎng)基上經(jīng)培養(yǎng)后可長成菌落。各種細(xì)菌在培養(yǎng)基上生長成的菌落形態(tài)各不相同。根據(jù)菌落的大小、表面高起或扁平、光澤、色素和邊緣的情況等，作為細(xì)菌鑒定的標(biāo)準(zhǔn)。 【方法】 1．取材 培養(yǎng)要獲得成功，取材的部位和方法要準(zhǔn)確。由男性病人前尿道取材時，應(yīng)該用細(xì)小棉拭子或藻酸鈣拭子或白金耳伸入尿道口 2cm~4cm，取出的分泌物應(yīng)略帶粘膜。從女病人的 宮頸取材時，應(yīng)先用溫水濕潤擴陰器 (不要用液體石蠟等潤滑油 )。應(yīng)將棉拭插入宮頸口 ，稍轉(zhuǎn)動并停留 10s~30s，讓棉拭充分吸附分泌物。從直腸取材時，應(yīng)將棉拭插入肛門 ，如果棉拭碰到糞便，應(yīng)換一個棉拭重取。檢查淋菌性咽炎時，應(yīng)從扁桃體及扁桃體窩取材。為了提高陽性率，可同時取二份標(biāo)本進(jìn)行培養(yǎng)。 2．培養(yǎng)基 由于淋球菌的營養(yǎng)要求較復(fù)雜，所用的培養(yǎng)基中應(yīng)含有動物蛋白及細(xì)菌生長所需的各種因子。目前國內(nèi)常用的是血液瓊脂或巧克力瓊脂。為抑制雜菌，在培養(yǎng)基中可加入少量抗菌物質(zhì)如多粘菌素 B(25181。g /ml)和萬古霉素 ( 181。g /ml)等。所用血液如羊血、兔血和人血均可，濃度為 8%~10%。但避免血液中加入抗凝劑等藥物。培養(yǎng)基的 pH 值以 為好。目前國外常用的培養(yǎng)基有 ThayerMartin(TM)培養(yǎng)基、 NewYork City(NYC)培養(yǎng)基和 MartinLewis(ML)培養(yǎng)基等。 TM 培養(yǎng)基是在 GC 基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，加入血紅蛋白 (1%)、抗生素 (萬古霉素 3181。g /ml、粘菌素 /ml 和制霉菌素 /ml)和淋球菌增菌劑，使絕大多數(shù)雜菌被抑制而淋球菌菌落長得較大，在乎皿中幾 乎呈純培養(yǎng)，從而大大提高了由子宮頸、尿道，尤其是咽和直腸部位分離出淋菌的陽性率。 第 5 頁 共 111 頁 3．培養(yǎng)條件 淋球菌對外環(huán)境變化頗為敏感，對寒冷和干燥抵抗力很弱。因此，為了保證培養(yǎng)有足夠的成功率，取材后應(yīng)立即接種，標(biāo)本離體時間越短越好。取材處離實驗室距離較遠(yuǎn)時，應(yīng)將標(biāo)本接種于 Smart 或 Amies 運送培養(yǎng)基或 1%葡萄糖肉浸液中，并注意在運送過程中保溫。接種的血平皿應(yīng)先放在 37℃ 溫箱中預(yù)溫。培養(yǎng)的最適溫度為 35℃ ~36℃ ，超過 ℃ 或低于 30℃ 便生長不良。因此，孵育的溫度要恒定。淋球菌為需氧菌，但最初從人體分離 時，為促進(jìn)生長，需用 5%二氧化碳環(huán)境培養(yǎng)。為保持一定的濕度，可在培養(yǎng)缸中放些浸水棉球。 【結(jié)果】 淋球菌在血平皿上經(jīng) 24h~48h 的培養(yǎng)后，可形成圓形、凸起、濕潤、光滑、半透明或灰白色菌落。邊緣呈花瓣狀，直徑為 ~。用白金耳觸之有粘性。如繼續(xù)培養(yǎng)，菌落面積增大，表面變得粗糙，邊緣出現(xiàn)皺縮。若從菌落上取材作涂片，可見到菌的大小及染色的深度有差異，排列也不一致，約有 25%的菌為典型的雙球菌，其他 75%為單球菌、四聯(lián)形或八疊形。 淋球菌在液體培養(yǎng)基中生長于液體表面，或稍有輕度混濁和顆粒沉淀。 【注意事項】 1．培養(yǎng)要獲得成功，取材是關(guān)鍵之一。取材的深度一定要夠，因為淋球菌好發(fā)于柱狀上皮細(xì)胞而不是復(fù)層鱗狀上皮細(xì)胞。男性尿道前端包括舟狀窩都為復(fù)層鱗狀上皮覆蓋，所以要深人到尿道內(nèi) 2cm~4cm處，并蘸取少量粘膜，陽性率才高。女性病人取材時，要求將棉拭插入宮頸管，轉(zhuǎn)動并停留 10s~30s 也是這個道理。有些人只在陰道口取少量分泌物作分離培養(yǎng)，陽性率當(dāng)然會降低，因為有生活力的菌從宮頸隨分泌物由陰道流出需一定時間，陰道內(nèi) pH 值低，又因各種雜菌的作用，到陰道口時淋菌的生活力較低，再加上培養(yǎng)過程中各種因素的影響 ，培養(yǎng)成功的機會就會減少。 2．對癥狀不典型的男病人取材，最好是在晨起排尿前或排尿后 2~3h 之后。另外， 第 6 頁 共 111 頁 采樣者應(yīng)熟練掌握前列腺按摩術(shù)，必要時作前列腺按摩取材。 3．對女性淋病的檢查主張用淋球菌培養(yǎng)。國內(nèi)目前使用血液瓊脂加入多粘菌素作抑菌劑效果尚可。但蛋白胨最好用進(jìn)口的 (Oxoid 公司產(chǎn)品或日本產(chǎn)或Polypepton 等 )，并用肉浸液加酵母浸膏等為好。 4．國內(nèi)目前使用的血液瓊脂或巧克力瓊脂中加人多粘菌素和萬古霉素以分別抑制革蘭陰性和革蘭陽性雜菌。但由于部分淋球菌 (某些地區(qū)可高達(dá) 5%)對萬古霉素也敏感，因此， 最好不用萬古霉素。 5．淋球菌在血平板上培養(yǎng) 24h，雖能見到菌落，但個兒很小，難以辨認(rèn)其特點。24h~36h，菌落迅速長大。所以觀看菌落特征最好在 36h 左右。超過 36h，菌落特征也會有較大的改變。 【臨床意義】 淋球菌培養(yǎng)用作診斷和某些特殊目的。培養(yǎng)法對男性及女性標(biāo)本都是適用的，是世界衛(wèi)生組織推薦的篩查淋病病人的唯一方法，也是診斷淋病的金標(biāo)準(zhǔn)方法。 初步鑒定試驗 革蘭染色 【原理】 淋球菌有特定形態(tài)。挑取可疑菌落在玻片上制成鹽水涂片，經(jīng)革蘭染 色，若見到具淋菌特征形態(tài)的雙球菌，可作出初步診斷。 【方法】 在載玻片上加鹽水一滴，取可疑菌落制成涂片，干燥固定后作革蘭染色。 【結(jié)果】 可見革蘭陰性球菌。菌體為 大小，呈腎形或卵圓形。約 1/4為雙球菌，多數(shù)為單球菌，個別呈四聯(lián)或八疊狀。與分泌物涂片所見不同，此涂片中無白細(xì)胞。 第 7 頁 共 111 頁 【注意事項】 1． 涂片厚薄要均勻，革蘭氏染色正確，必要時做陰性和陽性對照。 2． 陳舊的培養(yǎng)物，涂片顏色結(jié)果不典型，應(yīng)取新鮮培養(yǎng)物。 【臨床意義】 典型革蘭氏陰性雙球菌表明可能為淋球菌，但必須進(jìn)一步做試驗鑒 定。 氧化酶試驗 【原理】 淋球菌在生長過程中產(chǎn)生氧化酶。往培養(yǎng)基上生長了 24h~48h 的菌落上加氧化酶試劑 (%~1%新配制的鹽酸四甲基對苯二胺或鹽酸二甲基對苯二胺水溶液 )，淋球菌菌落的顏色可變成紫紅乃至黑色。 【方法】 1．在混有雜菌的淋球菌分離平皿上滴加氧化酶試劑后變成紫紅色的菌落為氧化酶試驗陽性。 2．也可先挑取可疑菌落涂于干濾紙條上，滴加試劑，涂菌處變成紅色者為陽性。 3．或先滴一滴試劑于濾紙條上 (勿太濕 )，再涂菌落，觀察顏色變化。 【結(jié)果】 淋球菌氧化酶陽性，但氧化酶陽性者并不一定是 淋球菌。 【注意事項】 1．為了保證育良好的反應(yīng)，所用氧化酶試劑不應(yīng)過分陳舊。正常的氧化酶試劑 (鹽酸二甲基對苯二胺或鹽酸四甲基對苯二胺 )應(yīng)為談紅色。如果試劑買來時已成灰色或黑色，說明已失效而不應(yīng)使用。試劑溶液配好后應(yīng)放在棕色玻璃瓶中避光保存可使用一周。 2．氧化酶試劑遇鐵也會出現(xiàn)紅色而造成假陽性，所以操作用的接種環(huán)應(yīng)避免用舊鐵絲或電爐絲等制成．并在每次試驗前先檢查是否末挑茵的接種環(huán)接觸試劑就有紅色出現(xiàn)。 第 8 頁 共 111 頁 3．鹽酸四甲基對苯二胺比鹽酸二甲基對苯二胺敏感，將一滴鹽酸叫甲基對苯二胺溶液滴在菌落上，如菌落很快變?yōu)?深紫色并保留半 分鐘 以上則為陽性。所以，在測定杜克雷菌等氧化酶試驗弱陽性的菌株時，最好用前者。 4．如需保留 菌 種，在菌落末完全變黑時可挑少許轉(zhuǎn)種。菌落一旦變黑，多數(shù)菌即告死亡。