重組dna-分子克隆技術(shù)(參考版)
2025-01-24 16:12本頁面
【正文】 ? 如在植物表達載體上引入抗性基因、熒光蛋白等，可用以抗性篩選和表達檢測 ? 在載體上引入強啟動子或增強子，使目的基因在特定組織中能夠大量表達 ? 在普通載體上引入內(nèi)含子和 mcs，構(gòu)建為專門用于RNAi的載體 。 ? 首先要分析載體的全序列，確保在載體的其他位點不具有該酶切位點。這樣通過插入一柔性Linker保持了兩種蛋白各自的構(gòu)象和功能。 ? 如 GST－目的基因、 His－目的基因、熒光蛋白－目的基因等。包括酶切溫度，緩沖液，酶切效率等。選擇表達載體多克隆位點處具有的而目的序列內(nèi)部沒有的酶切位點，引入引物的 5末端。 ? （ 8） 對引物的修飾一般是在 5’端增加酶切位點，應(yīng)根據(jù)下一步實驗中要插入 PCR產(chǎn)物的載體的相應(yīng)序列而確定。引物的 3’ 端的 Δ G值過高，容易在錯配位點形成雙鏈結(jié)構(gòu)并引發(fā) DNA聚合反應(yīng)。 ? （ 6） Δ G值是指 DNA雙鏈形成所需的自由能，該值反映了雙鏈結(jié)構(gòu)內(nèi)部堿基對的相對穩(wěn)定性。 ? （ 5） 引物所對應(yīng)模板位置序列的 Tm值在 72℃ 左右可使復性條件最佳。 ? （ 4） 引物序列的 GC含量一般為 4060%，過高或過低都不利于引發(fā)反應(yīng)。另外，引物二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu)也可能導致 PCR反應(yīng)失敗。 ? （ 3） 引物 3’ 端的末位堿基對 Taq酶的 DNA合成效率有較大的影響。 （ 2） 引物序列在模板內(nèi)應(yīng)當沒有相似性較高，尤其是 3’端相似性較高的序列，否則容易導致錯配。通常用的轉(zhuǎn)基因植物的操作有農(nóng)桿菌介導法、花粉管通道法和基因槍方法。尤其是哺乳類動物細胞，不僅可表達真核的 cDNA，而且還可表達真核基因組 DNA；將表達載體導入真核細胞的過程稱轉(zhuǎn)染，常用于細胞轉(zhuǎn)染的方法有：磷酸鈣轉(zhuǎn)染、 DEAE葡聚糖介導轉(zhuǎn)染、電穿孔法、脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染及顯微注射。 大腸桿菌表達體系中尚有一些不足之處： ※ 由于缺乏轉(zhuǎn)錄后加工機制，只能表達克隆的 cDNA， 不宜表達真核基因組 DNA ※ 由于缺乏適當?shù)姆g后加工機制，表達的真核蛋白 質(zhì)不能形成適當?shù)恼郫B或進行糖基化修飾 ※ 表達的蛋白質(zhì)常常形成不溶性的包涵體，欲使其具 有活性尚需進行復雜的復性處理 ※ 很難表達大量的可溶性蛋白。 ※ 原位雜交 ※ Southern印跡 利用特異抗體與目的基因表達產(chǎn)物相互作 用進行篩選。 2. 酶切和電泳 ? 挑取單菌落，于液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)； ? 收集菌體，提取純化質(zhì)粒； ? 對質(zhì)粒進行限制性內(nèi)切酶酶切； ? 瓊脂糖凝膠電泳檢測； ? 根據(jù)酶切產(chǎn)物的大小，鑒定陽性克隆。 （ 1）抗藥性標志選擇： 如果克隆載體攜帶有某 種抗藥性標志基因，則只有含這種抗藥基因 的轉(zhuǎn)化子細菌才能在含該抗菌藥物的培養(yǎng)板 上幸存并形成菌落。 感染： 以噬菌體為載體，在體外將噬菌體 DNA包裝成病毒顆粒，使其感染受體菌。 轉(zhuǎn)化： 以質(zhì)粒為載體，將攜帶外源基因的載 體 DNA導入受體細胞。受體菌應(yīng)為安全無毒菌株，且為限制酶缺陷型及重組缺陷型。 。 同聚物加尾連接 5’ 5’ 5’ 5’ AAA AAA TTT TTT TdT酶 連接酶 4．人工接頭連接 由平端加上帶有新的酶切位點的寡核苷 酸，再用限制酶切產(chǎn)生粘性末端，進行 連接。 (2)不同限制酶切割位點連接 由兩種不同的限制性核酸內(nèi)切酶切割的 DNA片段，具有相同類型的粘性末端，即配對末端 粘端連接 CCGG CCGG GGCC GGCC CGG C C GGC CGG C C GGC CCG
教學課件相關(guān)推薦
鄂ICP備17016276號-1