【文章內容簡介】 感受態(tài)細胞的制備體外連接的 DNA 重組分子導入合適的受體細胞才能大量增殖。為了提高受體菌攝取外源 DNA 的能力，提高轉化效率以獲得更多的轉化子，人們摸索出了不同的方法處理細菌，使其處于感受態(tài)。目前主要采用電轉化法和 CaCl2法將外源 DNA 導入受體細胞中，并需要相應地制備電轉化感受態(tài)細胞和 CaCl2感受態(tài)細胞。實驗目的：學習感受態(tài)細胞的制備過程12實驗材料：大腸桿菌菌株 DH5?或 DH10B實驗原理：電轉化法是利用瞬間高壓在細胞上打孔，因而需用冰冷的超純水多次洗滌處于對數生長前期的細胞，以使細胞懸浮液中應含有盡量少的導電離子。轉化效率為 109～10 10 轉化子/181。g DNA；對于熱激法，是利用冰冷的 CaCl2 處理對數生長期的細胞，可以誘導其產生短暫的“感受態(tài)” ，易于攝取外源 DNA。轉化效率為 106 ～10 7 轉化子/181。g DNA。CaCl2感受態(tài)細胞的制備實驗步驟前夜接種受體菌（DH5?或 DH10B） ，挑取單菌落于 LB 培養(yǎng)基中 37℃搖床培養(yǎng)過夜（約 16 小時） ；取 1ml 過夜培養(yǎng)物轉接于 100ml LB 培養(yǎng)基中，在 37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)約 3 小時（250300rpm） ；將 CaCl2溶液置于冰上預冷；以下步驟需在超凈工作臺和冰上操作吸取 培養(yǎng)好的菌液至 離心管中，在冰上冷卻 10 分鐘；4℃下 3000 g 冷凍離心 5 分鐘；棄去上清，加入 100?l 預冷 CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸浮，在冰放置 20 分鐘；4℃下 3000 g 冷凍離心 5 分鐘；棄去上清，加入 100?l 預冷 CaCl2溶液，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；細胞懸浮液可立即用于轉化實驗或添加冷凍保護劑（15% 20%甘油）后超低溫冷凍貯存?zhèn)溆茫ǎ?0℃） 。電轉化法制備大腸桿菌感受態(tài)細胞的實驗步驟前夜接種受體菌（DH5?或 DH10B） ，挑取單菌落于 LB 培養(yǎng)基中 37℃搖床培養(yǎng)過夜；取 2ml 過夜培養(yǎng)物轉接于 200ml LB 培養(yǎng)基中，在 37℃搖床上劇烈振蕩培養(yǎng)至OD600＝（約 小時） ；將菌液迅速置于冰上。以下步驟務必在超凈工作臺和冰上操作吸取 培養(yǎng)好的菌液至 離心管中，在冰上冷卻 10 分鐘；4℃下 3000g 冷凍離心 5 分鐘，收集菌體，棄去上清。必要時可收集 2 次； 加入 1500?l 冰冷的 10%甘油，使細胞重新懸浮（先加 750?l 用移液槍輕輕上下吸動打勻，再加 750?l 混勻） ；134℃下 3000g 冷凍離心 5 分鐘；棄去上清，加入 750?l 冰冷的 10%甘油，用移液槍輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸??；4℃下 3000g 冷凍離心 5 分鐘；加入 20?l 冰冷 10%的甘油，用移液器輕輕上下吸動打勻，使細胞重新懸?。涣⒓词褂没蜓杆僦糜?0186。C 超低溫保存。附注：影響感受態(tài)細胞轉化效率的因素及實際操作過程中應注意的事項：細菌的生長狀態(tài)：實驗中應密切注視細菌的生長狀態(tài)和密度，盡量使用對數生長期的細胞（一般通過檢測 OD600 來控制。DH5?菌株 OD600 為 時細胞密度是 5107/ml） ；所有操作均應在無菌條件和冰上進行；經 CaCl2 處理的細胞，在低溫條件下，一定的時間內轉化率隨時間的推移而增加，24 小時達到最高，之后轉化率再下降（這是由于總的活菌數隨時間延長而減少造成的） ；化合物及無機離子的影響：在 Ca2+的基礎上聯(lián)合其他二價金屬離子（如 Mn2+或Co2+） 、DMSO 或還原劑等物質處理細菌，可使轉化效率大大提高（ 1001000 倍） ；所使用的器皿必須干凈。跡量的去污劑或其它化學物質的存在可能大大降低細菌的轉化效率；質粒的大小及構型的影響：用于轉化的應主要是超螺旋的 DNA；一定范圍內，轉化效率與外源 DNA 的濃度呈正比；實驗五 質粒的轉化及轉化子的鑒定質粒的轉化是指將質?；蛞运鼮檩d體構建的重組子導入細菌的過程。將連接產物轉化到感受態(tài)細胞中，實現重組克隆的增殖，便于后續(xù)分子操作?？梢圆捎枚喾N方法篩選和鑒定目的克隆。實驗目的：掌握熱激法或電轉化法轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞及轉化子的鑒定方法。14實驗材料：外源片段與載體的連接產物；大腸桿菌感受態(tài)細胞。實驗原理：（1）熱激法：大腸桿菌在 0℃ CaCl2 低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的 DNA 形成抗 DNase 的羥基－鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經 42℃短時間熱沖擊處理，促進細胞吸收 DNA 復合物，在豐富培養(yǎng)基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增殖。在被轉化的細胞中，重組子基因得到表達，在選擇性培養(yǎng)基平板上可挑選所需的轉化子。（2）電轉化法：外加于細胞膜上的電場造成細胞膜的不穩(wěn)定，形成電穿孔，不僅有利于離子和水進入細菌細胞，也有利于孔 DNA 等大分子進入。同時 DNA 在電場中形成的極性對于它運輸進細胞也是非常重要的。熱激法轉化實驗步驟：制備選擇性培養(yǎng)基平板：在融化的 250ml LA 培養(yǎng)基中 250 ?l Amp（100mg/ml） ，250 ?l Xgal (20mg/ml)，25 ?l IPTG (200mg/ml)，混勻后倒入滅菌培養(yǎng)皿中；取出 3 管制備好的感受態(tài)細胞，放在冰上融化；每 100 ?l 感受態(tài)細胞加入約 20ng 質粒 DNA，3 管分別加連接產物、標準超螺旋質粒 DNA（陽性對照）及不加入任何 DNA（陰性對照） ，用移液器輕輕吸打均勻，在冰上放置 30 分鐘；熱擊：將離心管放置 42℃水浴，熱擊 90 秒，注意：勿搖動離心管；冰鎮(zhèn)：快速將離心管轉移至冰浴，放置 1－2 分鐘；復蘇：每管加 400 ?l SOC 培養(yǎng)基，在 37℃搖床溫和搖動溫育 45 分鐘，使細菌復蘇；布皿：取適當體積均勻涂布于含有 IPTG、Xgal、抗生素（Amp）的 LA 平板；培養(yǎng)：倒置培養(yǎng)皿，于 37℃培養(yǎng) 12－16 小時 即可觀察到藍白相間的菌落（其中白色菌落為含有外源插入片段的轉化子，藍色菌落是載體自連的轉化子）質粒電轉化大腸桿菌感受態(tài)細胞操作步驟1．制備選擇性培養(yǎng)基平板：將融化的 250ml LA 培養(yǎng)基冷卻至 50186。C 左右，加入250 ?l Amp（100mg/ml） ，250 ?l Xgal (20mg/ml)，25 ?l IPTG (200mg/ml)，混勻后快速倒入滅菌培養(yǎng)皿中（注意：溫度太高，抗生素失活，溫度太低，培養(yǎng)基易凝固） ；2．取出制備好的感受態(tài)細胞，放在冰上融化；153．每管感受態(tài)細胞加入 1?l 連接產物，用移液器輕輕吸打均勻，置冰上；4．電轉化儀選擇 1800V 作為輸出電壓；5．將要轉化的混合物加入預冷的 1 mm 的電轉化杯中，立即按下按紐電擊；6．立即加 1ml SOC 培養(yǎng)基到轉化杯中重懸細胞；7．將細胞轉入合適的培養(yǎng)管中 37186。C 培養(yǎng) 1 小時；8．吸取合適體積的菌液涂布已倒好的選擇培養(yǎng)基平板；9．37186。C 培養(yǎng)過夜，觀察結果。附注：利用氨芐青霉素抗性篩選轉化子時，用轉化細胞鋪平板的密度要低（90mm 平板上不得超過 105 個菌落） ，同時 37℃培養(yǎng)不應超過 20 小時，具氨芐青霉素抗性的轉化體可將?－內酰胺酶分泌到培養(yǎng)基中，迅速滅活菌落周圍的抗生素，從而導致對氨芐青霉素敏感的衛(wèi)星菌落的出現。鑒定轉化子中是否含有外源 DNA 片段常用的方法有：?互補；雜交篩選；插入失活（一些老質粒如 pBR322 等）。小量提取質粒酶切檢測、PCR 檢測16系列二 Southern 技術（轉基因植物的陽性鑒定及插入的外源基因拷貝數檢測）主要通過檢測轉基因植物中插入的外源基因拷貝數做 Southern 雜交訓練分子 Southern 雜交的相關技術。Southern 雜交是即通過用選擇合適的限制性內切酶消化基因組或其它來源的 DNA，經過利用瓊脂糖凝膠電泳按大小分離酶切所得的片段，隨后 DNA 在原位發(fā)生變性并從凝膠轉移到一固相支持物上（一般是硝酸纖維素膜或如尼龍膜）上。DNA 轉移至固相支持物的過程中各 DNA 的相對位置保持不變，用一定方法（如放射性同位素、地高辛等）標記的 DNA 探針與固著在膜上的DNA 雜交，經 X光片自顯影或顯色反應顯現出與探針 DNA 互補的 DNA 電泳條帶的位置及數量。試驗目的： 了解掌握檢測 DNA 質量的方法以及 DNA 定量的方法；了解影響 DNA 在瓊脂糖凝膠中 泳動速率的因素；訓練 DNA 的瓊脂糖凝膠電泳操作及 DNA 的限制性內切酶操作。試驗原理：1. DNA 抽提： CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種非離子去污劑，植物材料在 CTAB 的處理下，結合 65?C 水浴使細胞裂解、蛋白質變性、DNA 被釋放出來。CTAB 與核酸形成復合物，此復合物在高鹽（）濃度下可溶，并穩(wěn)定存在，但在低鹽濃度（ NaCl）下 CTAB核酸復合物就因溶解度降低而沉淀，而大部分的蛋白質及多糖等仍溶解于溶液中。經離心棄上清后，CTAB核酸復合物再用 70－75% 酒精浸泡可洗脫掉 CTAB。再經過氯仿/異戊醇(24:1) 抽提去除蛋白質、多糖、色素等來純化 DNA，最后經異丙醇或乙醇等 DNA 沉淀劑將 DNA 沉淀分離出來。CTAB 法簡便、快速，DNA 產量高(純度稍次，適用于一般分子生物學操作)。2. 總 DNA 質量檢測：17在 pH 值為 時，核酸分子堿基幾乎不解離，磷酸全部解離，核酸分子帶負電，在電泳時向正極移動。采用適當濃度的凝膠介質作為電泳支持物，在分子篩的作用下，使分子大小和構象不同的核酸分子泳動率出現較大的差異，從而達到分離核酸片段檢測其大小的目的。核酸分子中嵌入熒光染料（如 EB）后，在紫外燈下可觀察到核酸片段所在的位置。雖然普通瓊脂糖凝膠無法分辨大于 50kb 的 DNA，但通過瓊脂糖凝膠電泳可以初步判斷得到的植物總 DNA 片段的大??；根據蛋白質、DNA 和 RNA 在 260nm/280nm 下的吸光值比值不同的，通過檢測 DNA 樣品260nm/280nm 下的吸光值比值可以初步判斷 DNA 樣品的純度。: 根據導入植物中的外源基因的序列，選擇合適的能夠區(qū)別出外源基因插入的拷貝數的探針/限制性內切酶組合 。限制性內切酶的特點（見基因操作原理）4. 轉膜：經毛細管（毛細吸附）作用，把 DNA 從凝膠上轉到膜上。DNA 轉到膜上是復制膠上的帶型，在 80100℃真空干燥 hrs 或紫外鉸鏈儀中照射一定時間，即可固定 DNA。 尼龍膜（帶正電荷的）強度高，不易破損，具有較大的 DNA 結合容量，它能夠吸附變性 DNA，共價結合 DNA 是最大優(yōu)點，尼龍膜兩邊均有同樣吸附 DNA 功能，可反復利用 10 次以上（1020 次） 。尼龍膜根據探針標記物不同，可以選擇的轉移緩沖液（transfer buffer）有高離子強度（10SSC 或 20SSC）的，也可用堿轉移（ NaOH） ，轉膜時間（duration of transfer）約 12 hrs，主要取決于轉膜時搭建的毛細吸附系統(tǒng)、DNA 大小、膠厚度(5 mm)及濃度(1%)。依據堿基配對原則，用放射性同位素標記或地高辛標記的 DNA 探針，與固著在膜上的靶 DNA 雜交，經放射自顯影（放射性同位素）或免疫顯色反應（地高辛標記）確定靶 DNA 的位置。5.．探針的標記：隨機引物標記法是在 DNA 聚合酶的作用下，寡核苷酸通過與單鏈的模板配對可以啟動 DNA 的合成的原理設計的，如果寡核苷酸序列是不同的（heterogeneous） ，引物中包含所有可能的隨機序列（如 6 堿基引物則有 46=4096 種）18，可以與任意模板序列相配對在許多位置形成雜交鏈，四種核苷酸底物中有一種是用放射性同位素標記的或用地高辛標記的 aadUTP 代替 dTTP，則可產生均勻一致高比活放射性探針或地高辛標記的探針。The klenow fragment 去除了 E．Coli DNA polymerase I 的 5’→ 3’的外切酶活性，具有 5’→ 3’的聚合酶活性及 3’→ 5’ 外切酶活性；標記的探針 DNA 的平均長度與 引物的濃度成反比 [=k/(lnPc)1/2， Pc 是引物的濃度] ，一般可產生約 400600 bp 的標記產物；模板 DNA 一般采用線狀雙連 DNA。環(huán)狀 DNA 用限制性內切酶切成線狀，再標記。7. 預雜交和雜交：膜上有許多沒有結合 DNA 分子的地方，若不在雜交前用一些封閉劑結合位點，加入探針后，探針 DNA 分子將會結合在這些位點上，導致雜交背景深，預雜交的目的是用非特異性 DNA 分子（鮭精 DNA）及其它高分子化合物（封閉劑）將待雜交膜中的非特異性位點封閉，從而減少雜交背景。 雜交：標記好的探針，加到雜交液中，在一定（溫度下）條件下，使探針與膜上的 DNA 通過堿基互補配對原則結合在一起。8． 洗膜：用不同組成及離子強度的（嚴謹度）溶液，洗去膜上的封閉劑及非特異性雜交的探針9． 放射自顯影或顯色：用同位素標記的探針根據信號強弱，將洗好的尼龍膜壓 X光片或磷屏一定時間后，沖洗 X光片或掃描磷屏獲得雜交圖像；若使用地高辛標記的探針，則是將洗好的雜交膜進行一系列免疫顯色反應得到雜交圖像。10． 放射性同位素：Southern 雜交實驗常用的是 32P 標記的 dNTP。 32P 半衰期是 天，衰變放出 β 粒子最大能量 ，最大輻射范圍：空氣中 610cm，水中 ，有機玻璃中 ；