【正文】 CT值35表明反應(yīng)中靶的數(shù)量太少；對于CT值35的情況，期望更高的標(biāo)準(zhǔn)偏差。CT值8且35較理想。軟件將反應(yīng)孔按CT值分為：低、中、高和未確定。標(biāo)記表示軟件已在標(biāo)記反應(yīng)孔內(nèi)找到錯誤。無標(biāo)記反應(yīng)孔。（分類方式）下拉菜單中，選擇Flag（標(biāo)記）。查看Quantity（數(shù)量）列以確保每個重復(fù)反應(yīng)組的數(shù)量值相同。請注意每個重復(fù)反應(yīng)組內(nèi)的數(shù)量相同。(注意：一次只能選擇一個類別)（分類方式）下拉菜單中，選擇Replicate（重復(fù)）。2）使用（分類方式）下拉菜單，以按特定類別將反應(yīng)孔分類。查看反應(yīng)孔表WellTable（反應(yīng)孔表）顯示反應(yīng)板中每個反應(yīng)孔的數(shù)據(jù)，包括：?樣本名稱、靶名稱、任務(wù)和染料?計算的閾值循環(huán)(CT)值、歸一化熒光(Rn)值和量值?注釋?標(biāo)記查看反應(yīng)孔表以檢查：?數(shù)量值?標(biāo)記?CT值（包括CT標(biāo)準(zhǔn)偏差）1）從ExperimentMenu（實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇Analysis（分析），然后選擇ViewWellTable（查看反應(yīng)孔表）選項(xiàng)卡。在示例實(shí)驗(yàn)中，閾值位于指數(shù)級擴(kuò)增階段。（閾值）復(fù)選框以顯示閾值。5）查看閾值：（圖形類型）下拉菜單中，選擇Log（對數(shù)）。4）查看基線值：（圖形類型）下拉菜單中，選擇Linear（線性）。（標(biāo)記曲線顏色方式）下拉菜單中，選擇Well（按反應(yīng)孔）。（選擇反應(yīng)孔）下拉菜單中，選擇Target（靶），然后選擇RNaseP（示例）。注意：如果AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕上未顯示數(shù)據(jù)，單擊Analyze（分析）。因此，建議在分析完成后檢查AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕，并查看為每個反應(yīng)孔指定的基線值和閾值。典型擴(kuò)增曲線包含：（幾何級增長期）。每條曲線可采用圖形方式查看：線性或log10。此曲線將閾值循環(huán)(CT)作為反應(yīng)孔位置的函數(shù)顯示。您可通過此圖來識別和檢查不規(guī)則擴(kuò)增。?Rn隨循環(huán)變化－Rn是歸一化報告熒光染料。此曲線將?Rn作為循環(huán)數(shù)的一個函數(shù)顯示。查看擴(kuò)增曲線①AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕上顯示所選反應(yīng)孔內(nèi)所有樣本的擴(kuò)增情況。8）檢查CT值：（查看反應(yīng)孔表）選項(xiàng)卡。7）檢查所有樣本均在標(biāo)準(zhǔn)曲線內(nèi)。–R2值為1。6）查看標(biāo)準(zhǔn)曲線下面顯示的值。4）從PlotColor（曲線顏色）下拉菜單中，選擇Default（默認(rèn)）。2）在ViewPlateLayout（查看反應(yīng)板布局）選項(xiàng)卡上單擊反應(yīng)板布局的左上角，以在StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）屏幕上顯示全部48個反應(yīng)孔。1）從ExperimentMenu（實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇Analysis（分析）StandardCurve（標(biāo)準(zhǔn)曲線）。CT值8表明反應(yīng)中有太多模板。?CT值閾值循環(huán)(CT)是熒光水平達(dá)到閾值時的PCR循環(huán)數(shù)。?R2值（相關(guān)系數(shù)）R2值表示標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸線與標(biāo)準(zhǔn)反應(yīng)的單個CT數(shù)據(jù)點(diǎn)之間的擬合程度。–標(biāo)準(zhǔn)品重復(fù)數(shù)，為了獲得更準(zhǔn)確的效率測量值，包括重復(fù)數(shù)以降低移液誤差的影響。斜率接近?，即100%PCR擴(kuò)增效率。StepOne軟件根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算未知靶的數(shù)量。，從每條曲線顯示上方的下拉菜單中選擇該曲線。，單擊∶Showplotsintworows（以兩行顯示曲線）。要在MultiplePlots（多曲線）屏幕內(nèi)導(dǎo)航：（實(shí)驗(yàn)菜單）窗格中，選擇Analysis（分析）→MultiplePlotsView（多曲線視圖）。，單擊反應(yīng)板布局的左上角。，在反應(yīng)板布局中單擊該反應(yīng)孔。（視圖）選項(xiàng)卡－為已打開的實(shí)驗(yàn)顯示反應(yīng)板布局或反應(yīng)孔表（實(shí)驗(yàn)）選項(xiàng)卡－為每個打開的實(shí)驗(yàn)顯示一個選項(xiàng)卡。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)打開StepOne，從Home屏幕上，單擊Open，在對話框中，導(dǎo)航到experiments文件夾，找到創(chuàng)建的試驗(yàn)設(shè)計，打開實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)文件，單擊Analyze（分析），軟件使用默認(rèn)分析設(shè)置來分析數(shù)據(jù)。并置數(shù)據(jù)的傳輸是自動傳輸。切記！不要在運(yùn)行后關(guān)閉StepOne擴(kuò)增儀電源開關(guān)。3）從樣本加熱塊中取出反應(yīng)板。當(dāng)StepOne擴(kuò)增儀完成一次運(yùn)行時，系統(tǒng)會將運(yùn)行詳情保存到運(yùn)行歷史記錄，在擴(kuò)增儀完成另一次運(yùn)行之前，該運(yùn)行歷史記錄會保留在系統(tǒng)中。2）遠(yuǎn)程監(jiān)視若將您的StepOne擴(kuò)增儀連接到網(wǎng)絡(luò)，您可使用StepOne軟件的遠(yuǎn)程監(jiān)視功能從網(wǎng)絡(luò)上的任何一臺計算機(jī)上實(shí)時查看運(yùn)行進(jìn)度。?單擊SendtoInstrument（發(fā)送到擴(kuò)增儀）。–若您想要將解鏈曲線階段添加到運(yùn)行的末尾，則選擇AddMeltCurveStagetoEnd（將解鏈曲線階段添加到末尾）。更改運(yùn)行方法（添加循環(huán)、保持或解鏈曲線）?在導(dǎo)航窗格中，單擊RunMethod（運(yùn)行方法）。（運(yùn)行方法）屏幕上查看運(yùn)行進(jìn)度開始運(yùn)行之后，StepOne系統(tǒng)會在RunMethod（運(yùn)行方法）屏幕上顯示運(yùn)行進(jìn)度。?HeatedCover（受熱護(hù)蓋門）曲線應(yīng)保持方法中指定的常溫。?通常，Sample（樣本）和Block（樣本加熱塊）曲線應(yīng)大約相互對應(yīng)。TemperaturePlot（溫度曲線）屏幕對識別硬件故障十分有用。異常擴(kuò)增可能包括以下情況：?陰性對照反應(yīng)孔中熒光增強(qiáng)。擴(kuò)增曲線將對照歸一化染料熒光(?Rn)循環(huán)數(shù)。AmplificationPlot（擴(kuò)增曲線）屏幕允許在StepOne擴(kuò)增儀運(yùn)行期間采集熒光數(shù)據(jù)時查看樣本擴(kuò)增。–StopafterCurrentCycle/Hold（當(dāng)前循環(huán)/保持階段后停止）以在當(dāng)前循環(huán)或保持階段之后停止運(yùn)行。在StepOne軟件中，單擊STOPRUN（停止運(yùn)行）。2）單擊STARTRUN（啟動運(yùn)行）。啟動運(yùn)行若計算機(jī)已通過StepOne系統(tǒng)線纜直接連接到StepOne擴(kuò)增儀，則執(zhí)行下列步驟。?若使用反應(yīng)管條帶，則將條帶置于樣本加熱塊中。2）裝載反應(yīng)板（帶無粉手套）。三、運(yùn)行試驗(yàn)準(zhǔn)備運(yùn)行打開實(shí)驗(yàn)并將密封的MicroAmpTMFastOptical48WellReactionPlate裝載到StepOneTM擴(kuò)增儀以準(zhǔn)備運(yùn)行。您可以：–接受軟件自動生成的反應(yīng)板布局。注意：當(dāng)您準(zhǔn)備自己的標(biāo)準(zhǔn)曲線實(shí)驗(yàn)時：?確保您使用適當(dāng)?shù)暮牟摹?）短暫地離心反應(yīng)板以除去氣泡。（樣本）反應(yīng)預(yù)混液。L)1pop1Reactionmixpop12Pop2ReactionmixPop2，然后蓋上各反應(yīng)管蓋。反應(yīng)管未知樣本反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量(181。L)1Std1ReactionmixStd12Std2ReactionmixStd23Std3ReactionmixStd34Std4ReactionmixStd45Std5ReactionmixStd5，然后蓋上各反應(yīng)管蓋。反應(yīng)管標(biāo)準(zhǔn)品反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量(181。L）1Reactionmix，然后蓋上反應(yīng)管蓋。反應(yīng)管反應(yīng)預(yù)混液反應(yīng)預(yù)混液劑量（181。采用StepOne軟件中顯示的反應(yīng)板布局。解凍時，進(jìn)行振蕩以重新懸浮樣本，然后短暫地離心反應(yīng)管。–振蕩反應(yīng)管以重新懸浮檢測母液，然后短暫地離心反應(yīng)管。6）將反應(yīng)預(yù)混液置于冰上，直到準(zhǔn)備好反應(yīng)板。4）用移液槍輕輕吸入并排出反應(yīng)預(yù)混液使其混合，然后蓋上反應(yīng)管蓋。計算中包括額外劑量，以便為試劑轉(zhuǎn)移期間發(fā)生的損失提供多余劑量。3）將所需劑量的每種組分添加到反應(yīng)管中：母液（）、檢測母液（）、加上10%，注意：將檢測母液置于冰柜中避光儲存，直到準(zhǔn)備使用。準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液使用StepOne軟件計算的組分和劑量準(zhǔn)備反應(yīng)預(yù)混液。，然后短暫地離心反應(yīng)管。，然后短暫地離心反應(yīng)管。，然后短暫地離心反應(yīng)管。，然后短暫地離心反應(yīng)管。，然后短暫地離心反應(yīng)管。