真核基因組dna提取(參考版)
2025-05-15 00:43本頁面
【正文】 若條帶大小大于 28s，則可能有基因組 DNA的污染，用DNase I處理 DNA污染較好。 3. RNA電泳 可能是兩種 rRNA (28s和 18s)，條帶亮度比例約 2:1。 注意 1. RNA濃度 : RNA (mg/mL) = OD260 稀釋倍數(shù) 40/1000。 ? 小心收集上清層后，經(jīng) 異丙醇沉淀 即可回收得到總 RNA。 RNA提取原理 ? 商業(yè)化試劑盒（ RNAiso plus試劑、 TRIzol reagent）中含有 強(qiáng)變性劑（如異硫氰酸胍）， 能夠充分裂解細(xì)胞，溶解蛋白質(zhì)，使核蛋白與核酸分離。 ? ③ 實(shí)驗(yàn)者本身：戴一次性干凈手套、口罩，避免外界環(huán)境中 RNA酶降解 RNA。 總 RNA的提取 提取 RNA實(shí)驗(yàn)的關(guān)鍵 ___嚴(yán)格防止 RNase的污染 核糖核酸酶 (RNase): 催化降解 RNA為小分子片段的核酸酶 無處不在 體內(nèi)： 取材要新鮮或液氮保存； 破碎細(xì)胞要快，盡量在低溫下進(jìn)行 體外： 空氣、試劑、耗材及實(shí)驗(yàn)者本身 體外 RNAase的去除 ? ① 所用的各種器皿：將玻璃器皿、離心管、吸頭等浸泡于% DEPC溶液中 37℃ 下處理 12 h， 121℃ 高壓滅菌 30 min，再烘干。用采用特意引物的 PCR直接從基因組 DNA中分離基因。 ? 由于 Southern 印跡雜交的高靈敏度和高特異性，它廣泛被應(yīng)用在遺傳病檢測、 DNA指紋分析和 PCR產(chǎn)物判斷等研究中。 基因組文庫構(gòu)建 構(gòu)建基因組文庫用載體 ?λ噬菌體置換型載體或黏粒載體 ?質(zhì)粒載體：小，只能用于構(gòu)建葉綠體基因組文庫。 ?應(yīng)用于 ?構(gòu)建基因組文庫 ?southern雜交 ?PCR技術(shù) 44 ?基因組 DNA文庫（ genomic DNA library） 從生物組織細(xì)胞 提取出基因組 DNA，用物理方法（超聲波、攪拌剪力等）或酶法（限制性核酸內(nèi)切酶的不完全酶解）將 DNA降解成預(yù)期大小的片段 ，然后將這些片段 與適當(dāng)?shù)妮d體 （常用噬菌體、粘?；?YAC載體） 連接 ， 轉(zhuǎn)入受體細(xì)菌或細(xì)胞 ，這樣每一個細(xì)胞接受了含有一個基因組 DNA片段與載體連接的重組 DNA分子，而且可以繁殖擴(kuò)增， 許多細(xì)胞一起組成一個含有基因組各 DNA片段克隆的集合體 。 43 提取真核基因組 DNA的應(yīng)用 ?基因組 —包含了某物種生長、發(fā)育、繁殖等各項生理活動的幾乎全部信息量，因而對真核細(xì)胞基因組的結(jié)構(gòu)組成，以及表達(dá)調(diào)控的研究至關(guān)重要。 思考題 ? 1. 簡述真核基因組結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。 電泳條件：電壓 80v（恒壓）；時間 30 min左右（根據(jù)指示劑遷移位置，判斷是否終止電泳） ② 電泳結(jié)束后，切斷電源，取出凝膠。 上樣緩沖液（ loading buffer） 作用：指示劑；沉降作用（含甘油），防止漂樣。 ② 樣品準(zhǔn)備：吸取 5 μL已提取的基因組 DNA點(diǎn)在點(diǎn)樣紙上，加入 1 μL 6 上樣緩沖液 ，用移液器輕輕混勻。 ③ 撥出梳子，將帶凝膠的膠床置于電泳槽中，并使樣品孔位于 電場負(fù)極 。 倒膠 ： ① 將冷卻 60℃ 的凝膠緩慢 倒入制膠模具 中，在膠一端 插上梳子 。 瓊脂糖凝膠制備及電泳 凝膠制備 倒膠 點(diǎn)樣 電泳 紫外燈下觀察 凝膠準(zhǔn)備 （ %） :用 1 TAE配制 1％瓊脂糖凝膠。 ? 瓊脂糖（ Agarose， AG）是瓊脂中 不帶電荷 的中性組成成份（幾乎不含硫酸根，主要成分為多糖），其水溶液可以制成凝膠，具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。 ?有些分光光度計則顯示 OD260/OD230，其比值應(yīng)在2~，偏小則說明有殘余鹽剩余。 OD260/OD280＞ RNA污染；
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