【正文】 供試液制備若需要用水浴加熱時(shí)，溫度。檢驗(yàn)時(shí)，應(yīng)從2個(gè)以上最小包裝單位中抽取供試品，一般應(yīng)隨機(jī)抽取不少于檢驗(yàn)用量（兩個(gè)以上最小包裝單位）的三倍量供試品。檢驗(yàn)量即一次試驗(yàn)所用的供試品。1）℃。單向流空氣區(qū)域、工作臺(tái)面及環(huán)境應(yīng)定期按《醫(yī)藥工業(yè)潔凈室（區(qū)）懸浮粒子、浮游菌和沉降菌的測(cè)試方法》的現(xiàn)行國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行潔凈度驗(yàn)證。微生物限度檢查應(yīng)在環(huán)境潔凈度10000級(jí)下的局部潔凈度100級(jí)的單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行。藥品微生物限度檢查方法驗(yàn)證方案 方 案 審 批1方案起草起草部門(mén)簽名日 期質(zhì)量控制部 年 月 日2方案會(huì)簽部 門(mén)簽 名日 期QC部長(zhǎng) 年 月 日微生物檢驗(yàn)員 年 月 日 QA部長(zhǎng) 年 月 日3方案批準(zhǔn)批 準(zhǔn) 人簽 名日 期質(zhì)量負(fù)責(zé)人 年 月 日4方案實(shí)施實(shí)施部門(mén)職 責(zé)質(zhì)量控制部對(duì)驗(yàn)證工作與檢驗(yàn)相關(guān)的數(shù)據(jù)的采集與檢驗(yàn)驗(yàn)證方案、報(bào)告的編寫(xiě)質(zhì)量保證部負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案和報(bào)告的審核對(duì)人員進(jìn)行培訓(xùn)文件進(jìn)行整理歸檔質(zhì)量負(fù)責(zé)人對(duì)驗(yàn)證工作全面主持批準(zhǔn)驗(yàn)證方案和報(bào)告微生物檢驗(yàn)員方案具體實(shí)施，并出具檢驗(yàn)記錄和報(bào)告 目 錄1. 概述2. 儀器設(shè)備3. 供試液的制備4. 細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)5. 控制菌檢查6. 驗(yàn)證品種項(xiàng)目表微生物限度檢查法概述微生物限度檢查法系檢查非規(guī)定滅菌制劑及其原料、輔料受微生物污染程度的方法?！段⑸锵薅葯z查SOP》 。，綜合整個(gè)驗(yàn)證過(guò)程，得出驗(yàn)證結(jié)論。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。. 離心沉淀集菌法 取規(guī)定量供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3~5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中度抑菌作用的樣品。. 培養(yǎng)基稀釋法 供試品有抑菌作用，放大培養(yǎng)基量，由1：100放大到1：300、1：500或1：1000，由于容器體積限制，一般放大到500ml或1000ml，本法適用于抑菌作用不強(qiáng)的樣品。 ◆金黃色葡萄球菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。 ◆銅綠假單胞菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入銅綠假單胞菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。 ◆沙門(mén)菌 取供試品10g或10ml，直接或處理后接種至適量（不少于200ml）的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，用勻漿儀或其他適宜方法混勻，陽(yáng)性菌對(duì)照加入沙門(mén)菌 10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)。 ◆大腸埃希菌 取相當(dāng)于1g或1ml供試品的供試液至100ml膽鹽乳糖培養(yǎng)基中，陽(yáng)性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照加入金黃色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，取此培養(yǎng)物按《微生物限度檢查SOP》大腸埃希菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。方法同試驗(yàn)組，驗(yàn)證大腸埃希菌、大腸菌群、沙門(mén)菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用金黃色葡萄球菌；驗(yàn)證銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、梭菌檢查法時(shí)的陰性對(duì)照菌采用大腸埃希菌。大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌的新鮮培養(yǎng)物至10ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)；%無(wú)菌氯化鈉溶液，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至105~107，制成每1ml含菌數(shù)10～100cfu的菌懸液。驗(yàn)證試驗(yàn)也可與供試品的控制菌檢查同時(shí)進(jìn)行。. 控制菌檢驗(yàn)方法驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行控制菌檢查方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的的控制菌檢查方法測(cè)定。若試驗(yàn)組的菌回收率（試驗(yàn)組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的平均菌落數(shù)的百分率）≥70%。試驗(yàn)組的菌回收率＝試驗(yàn)組的菌回收率—供試品對(duì)照組平均菌落數(shù)100%菌液組的平均菌落數(shù). 稀釋劑對(duì)照組回收率計(jì)算試驗(yàn)組的菌回收率＝稀釋劑對(duì)照組平均菌落數(shù)100%菌液組的平均菌落數(shù)計(jì)數(shù)方法驗(yàn)證至少應(yīng)進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)，并分別計(jì)算各試驗(yàn)菌每次試驗(yàn)的回收率。. 供試品對(duì)照組取規(guī)定量供試液，按菌落計(jì)數(shù)方法測(cè)定供試品本底菌數(shù)（方法和試驗(yàn)組相同）。至少要一張膜。（平皿法）：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液分別注入N個(gè)平皿中，每個(gè)平皿再注入50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。采用平皿法，取試驗(yàn)用的1ml菌液（約50～100cfu）分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)?！糁泻头ǎ哼x取適宜的中和劑如磺胺類(lèi)藥物加入適當(dāng)?shù)膶?duì)氨基苯甲酸，含重金屬的藥物在培養(yǎng)基內(nèi)加入巰基化合物如硫乙醇酸鈉半胱氨酸，洗必泰制劑加入聚山梨酸80（3%）或卵磷脂（3%），鹵素中加入硫代硫酸鈉（%）等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性后測(cè)定?！綦x心沉淀集菌法：取一定量的供試液，3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘（供試液如有沉淀，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘，取全部上清液再離心），棄去上清液，留底部集菌液約2ml，加稀釋液補(bǔ)至原量。每1ml供試液所注的平皿生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)?！艄腆w、半固體、粘稠性供試品供試品： 稱(chēng)取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～5ml %無(wú)菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫，吸至無(wú)菌試管內(nèi)，%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至104~106，制成每1ml含孢子數(shù)50～100cfu的孢子懸液。%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至106~107，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的菌懸液。驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)所用的菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代 （從菌種保存中心獲得的冷凍干燥菌種為0 代），并采用適宜的菌種保藏技術(shù)，以保證試驗(yàn)菌株的生物學(xué)特性。大腸埃希菌【CMCC（B）44102】、金黃色葡萄球菌【CMCC（B）26003】、枯草芽孢桿菌【CMCC（B）63501】、黑曲霉【CMCC（F）98003】、白色念珠菌【CMCC（F）98001】。、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證當(dāng)建立藥品的微生物限度檢查時(shí)，應(yīng)進(jìn)行細(xì)菌、霉菌及酵母菌計(jì)數(shù)方法的驗(yàn)證，以確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌的測(cè)定。根據(jù)樣品特性制訂檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件，按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。質(zhì)量部經(jīng)理：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案及報(bào)告的審核和批準(zhǔn)。QC負(fù)責(zé)人：負(fù)責(zé)驗(yàn)證方案中檢驗(yàn)方法的審核及按照規(guī)定的取樣計(jì)劃對(duì)標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)操作程序的準(zhǔn)確執(zhí)行，負(fù)責(zé)組織實(shí)施。驗(yàn)證管理員：負(fù)責(zé)驗(yàn)證工作的組織、協(xié)調(diào)及管理。通過(guò)驗(yàn)證確認(rèn)所采用的方法適合于該藥品的微生物限度的測(cè)定 。4. 在驗(yàn)證 驗(yàn)證時(shí)的檢驗(yàn)條件愛(ài)你發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)。，綜合整個(gè)驗(yàn)證過(guò)程，得出驗(yàn)證結(jié)論。若試驗(yàn)組檢出試驗(yàn)菌，按照該供試液制備方法和控制菌檢查法進(jìn)行該供試品控制菌的檢查；若試驗(yàn)組未檢出試驗(yàn)菌，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證。 結(jié)果判斷至少進(jìn)行3次獨(dú)立平行試驗(yàn)。 薄膜過(guò)濾法：采用薄膜過(guò)濾法時(shí)，取規(guī)定量供試液，過(guò)濾，沖洗，試驗(yàn)菌應(yīng)加在最后一次沖洗液中，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘取下面液體，并將適量的稀釋劑洗滌管底的洗滌液一并移入同瓶增菌液中，培養(yǎng)，本法適用于中等抑菌作用的樣品。按《微生物限度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》金黃色葡萄球菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。按《微生物限度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》沙門(mén)菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。按《微生物限度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》沙門(mén)菌項(xiàng)下規(guī)定檢查。 大腸菌群：取含適量（不少于10ml）的膽鹽乳酸發(fā)酵培養(yǎng)基管3支，分別加入含供試品1g或1ml、陽(yáng)性菌對(duì)照加入大腸埃希菌10～100cfu，陰性菌對(duì)照計(jì)入近換色葡萄球菌10～100cfu，35～37℃培養(yǎng)18～24小時(shí)，按《微生物限度檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程》大腸菌群項(xiàng)下規(guī)定檢查。陰性對(duì)照菌不得檢出。 陰性菌對(duì)照組設(shè)立陰性菌對(duì)照組是為了驗(yàn)證該控制菌檢查方法的專(zhuān)屬性。 驗(yàn)證用菌株大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、乙型付傷寒沙門(mén)菌、銅綠假單胞菌為驗(yàn)證用菌株，菌株傳代次數(shù)不得超過(guò)5代。若藥品的組分或原檢驗(yàn)條件發(fā)生改變可能影響檢驗(yàn)結(jié)果時(shí)，檢驗(yàn)方法應(yīng)進(jìn)行重新驗(yàn)證。. 在3次獨(dú)立的平行試驗(yàn)中，稀釋劑對(duì)照組的菌回收率（稀釋劑對(duì)照組的平均菌落數(shù)減去供試品對(duì)照組的平均菌落數(shù)占菌液組的品均菌落數(shù)的百分率）≥70%，應(yīng)采用自然沉降法、培養(yǎng)基稀釋法、離心沉淀集菌法、薄膜過(guò)濾法、中和法等方法或聯(lián)合使用這些方法消除供試品的抑菌活性，并重新進(jìn)行方法驗(yàn)證，是試驗(yàn)組菌回收率大于70%。最終濃度為每1ml供試液含50～100cfu，按試驗(yàn)組的供試液制備方法和技術(shù)方法計(jì)算。 稀釋劑對(duì)照組若供試劑需要分散、乳化、中和、離心或薄膜過(guò)濾法額、等處理時(shí)，應(yīng)增加稀釋劑對(duì)照組。 離心沉淀集菌法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋劑供試液，如供試液含許多藥渣，先以500轉(zhuǎn)/分鐘離心3～5分鐘，取全部上清液，再以3000轉(zhuǎn)/分離心20分鐘，取下面1ml液體，并用稀釋劑洗地管底，將洗滌液與1ml液體一起采用平皿法或薄膜過(guò)濾法計(jì)數(shù)。 薄膜過(guò)濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低級(jí)供試液，過(guò)濾，沖洗，在最后一次的沖洗液中加入50～100cfu試驗(yàn)菌，過(guò)濾，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌落數(shù)。 試驗(yàn)組 平皿法：取試驗(yàn)可能用的最低稀釋級(jí)1ml供試液和50～100cfu試驗(yàn)菌，分別注入平皿中，立即傾入培養(yǎng)基，每株試驗(yàn)菌平行制備2個(gè)平皿，按平皿法測(cè)定其菌落數(shù)。 菌液組：測(cè)定所加的試驗(yàn)菌數(shù)。 薄膜過(guò)濾法：取規(guī)定量試驗(yàn)可能用的最低稀釋劑供試液，過(guò)濾，沖洗嗎，按薄膜過(guò)濾法測(cè)定其菌落數(shù)?？刂凭鷻z查時(shí)可加大增菌液的用量。每1ml供試液所注的平皿生長(zhǎng)的菌數(shù)之和即為1ml的菌落數(shù)。 固體、半固體、粘稠性供試品：稱(chēng)取供試品10g置錐形瓶中，加稀釋劑至100ml，混勻后，作為供試液（1：10）。 黑曲菌菌液制備：接種黑曲菌的新鮮培養(yǎng)物至改良馬丁瓊脂斜面培養(yǎng)基中，23～28℃培養(yǎng)5～7天，加入3～%無(wú)菌氯化鈉溶液，將孢子洗脫，吸至無(wú)菌試管中，取1ml加無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至104～106，制成每1ml含數(shù)50～100cfu的孢子懸液。取此培養(yǎng)液%無(wú)菌氯化鈉溶液9ml，采用10倍遞增稀釋法，稀釋至106～107，制成每1ml含菌數(shù)50～100cfu的孢子懸浮液。驗(yàn)證試驗(yàn)可與供試品的細(xì)菌、霉菌及酵母菌級(jí)數(shù)同時(shí)進(jìn)行。驗(yàn)證用菌株的傳代次數(shù)不得才超過(guò)5代。五 驗(yàn)證方案內(nèi)容：、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、黑曲菌、白色念珠菌為驗(yàn)證用菌株。三 適用范圍：本方案適用于本公司生產(chǎn)的四種原料藥的微生物限度檢驗(yàn)方法的驗(yàn)證。根據(jù)樣品特性制定檢驗(yàn)方法和檢驗(yàn)條件按制定的方法進(jìn)行試驗(yàn)，根據(jù)驗(yàn)證結(jié)果判斷是否符合驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn)。 結(jié)論以上驗(yàn)證結(jié)果證明，本品 （適合/不適合）采用上述方法進(jìn)行微生物限度檢查。菌液組的平均菌落數(shù)100%；回收率應(yīng)均不低于70％檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期： 結(jié)果說(shuō)明經(jīng)過(guò)驗(yàn)證，大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉的回收率分別為： %、 %、 %、 %、 %。姓名: 年 月 日批準(zhǔn)意見(jiàn)： 姓名： 年 月 日備注 記錄表格樣品1樣品2樣品3名稱(chēng)批號(hào)確認(rèn)人： 日期： 產(chǎn)品試驗(yàn)組微生物生長(zhǎng)情況：批號(hào)： 菌種名稱(chēng)產(chǎn)品試驗(yàn)組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值12大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期： 供試品對(duì)照組微生物生長(zhǎng)檢查情況：批號(hào)： 菌種名稱(chēng)供試品對(duì)照組計(jì)數(shù)結(jié)果（cfu/皿）平均值12大腸埃希菌金黃色葡萄球菌枯草芽孢桿菌白色念珠菌黑曲霉檢驗(yàn)人： 日期： 復(fù)核人： 日期： 稀釋劑對(duì)照組微生物生長(zhǎng)檢查情況：批號(hào)： 菌種名稱(chēng)稀釋劑對(duì)照