【正文】 實驗室 主 題 文件編號 W003 廣東省汕尾逸輝基金醫(yī)院 檢驗科臨床微生物室 下呼吸道感染 細菌學檢驗 操作規(guī)范 第 24 頁 共 137 頁 第 1 版 第 0次修改 撰寫日期： 2020． 05． 10． 起 草 人 操 作 人 批 準 人 生效日期 痰及下呼吸道分泌物標本 ↓ 肉眼觀察及涂片革蘭染色細菌學和細胞學顯微鏡鏡檢 ↓ ↓ ↓ 初步報告 合格標本 不合格標本 ∣ 培養(yǎng)前處理 ∣ ∣ ∣ ↓ ∣ ∣ 拒收及建議重新采集合格標本 ∣ ∣ ∣ ↓ ↓ ↓ ∣ 血平板 巧克力平板 麥康凱 /中國蘭平板 ∣ (5％ C02 環(huán)境 ) (5％ C02，環(huán)境 ) (需氧環(huán)境 ) ∣ ↓ ∣ 菌落觀察 涂片染色鏡檢 ↓ ↓ 結(jié)合涂片細胞學和細菌學顯微鏡鏡檢結(jié)果與培養(yǎng)結(jié)果綜合分析 ↓ ↓ ↓ 細菌鑒定 藥敏試驗 ↓ ↓ 結(jié)合涂片細胞學和細菌學顯微鏡鏡檢與細菌學培養(yǎng)鑒定、藥敏結(jié)果綜合分析 ↓ 結(jié)果報告 (最終報告 ) 圖 1 痰及下呼吸道標本細菌學檢驗的操作流程 (3)結(jié)果分析 痰及下呼吸道分泌物標本易受到定植在上呼吸道的正常菌群污染，進行細菌學檢驗時通?？蓮乃蜋z的標本中分離出多種細菌，確定哪一種分離細菌是引起下呼吸道感染的病原菌，這對臨床診斷與治療感染性疾病至關(guān)重要。 3)麥康凱／中國蘭平板 適用于分離革蘭陰性桿菌。 2．一般細菌培養(yǎng) (1)培養(yǎng)基選擇 1)血平板 適用于分離肺炎鏈球菌和其他細菌。 四、分離培養(yǎng) 1．痰標本培養(yǎng)前處理 不含或含粘液很少的標本，可直接接種，遇有含大量粘液的標本，應(yīng)加入等量的液化劑 (如 的 10g/L 胰酶溶液等 )，放置 35℃待充分液化再行接種。 2．細菌涂片染色檢查 挑取痰液中膿性或帶血部份涂成均勻薄片，革蘭染色后鏡檢，油鏡下觀察細菌形態(tài)，排列和染色性，可初步推定菌屬 (或種 )，涂片中所見細菌的量及吞噬細胞內(nèi)是否有細菌等。合格的標準見表 3。 三、實驗室檢查 (一 )肉眼觀察 觀察痰液的顏色、粘度、有無血絲和是否呈膿性，如見有顆粒存在，則應(yīng)注意可能與放線菌屬及奴卡菌屬感染有關(guān)。 運送不符合規(guī)定 標本采集后送檢時間超過 2h 拒收。 標本涂片細胞學檢查 白細胞數(shù) 10/低倍鏡和鱗狀上皮細胞數(shù) 25/低倍鏡，提示該標本已污染正常菌群，建議重送標本。標本標識必須唯一，并與申請單相符，未標明采集時間、部位或檢驗要求等拒收。 表 2 下呼吸道細菌學培養(yǎng)標本驗收與拒收 厭氧菌培養(yǎng) 呼吸道定植有大量的正常菌群，咽試子、咳痰、吸出的分泌物厭氧菌培養(yǎng)無意 義。 (二 )標本驗收 遇有不合格標本，應(yīng)及時與臨床聯(lián)系，報告不合格標本拒收的具體理由。 3．小兒取痰法 用彎壓舌板向后壓舌，將拭子伸入咽部，小兒經(jīng)壓舌刺激咳嗽時，可噴出肺部或氣管分泌物粘在拭子上送檢。標本應(yīng)盡快送檢，不能及時送檢的標本，室溫保存≤ 2h。用力咳出呼吸道深部的痰，痰液直接吐入無菌、清潔、干燥、不滲漏、不吸水的廣口帶蓋的容器中，標本量應(yīng)≥ lml。 (一 )采集方法 1．自然咳痰法 以晨痰為佳，采集標本前應(yīng)用清水、冷開水漱口或牙刷清潔口腔和牙齒，有假牙者應(yīng)取下假牙。 下呼吸道感染患者可有發(fā)熱、咳嗽和咳痰，痰呈膿性、粘稠或血性，可伴有胸痛、氣急，肺部聞及濕羅音、白細胞總數(shù)及嗜中性粒細胞比例明顯增高， x線檢查提示肺部有炎癥性浸潤或胸腔積液等體癥，嚴重時可導致感染性休克和呼吸衰竭，因此臨床診斷一般不難；細菌學檢驗?zāi)苊鞔_感染病原，并提供有關(guān)抗菌藥物對分離菌的抗菌活性等信息，有助于疾病治療、流行病學調(diào)查研究和醫(yī)院感染的監(jiān)測。 社區(qū)獲得性肺炎常見的病原菌有肺炎鏈球菌、流感嗜血桿菌、金黃色葡萄球菌、卡他莫拉菌、肺炎克雷伯菌、軍團菌、肺炎支原體，肺炎衣原體等。下呼吸道感染包括急性氣管 支氣管炎、慢性支氣管炎急性發(fā)作、支氣管擴張繼發(fā)感染及肺實質(zhì)感染 (肺炎、肺膿腫 )等。 待冷卻至 50℃ 左右，加入中國藍、玫瑰紅水溶液混勻，立即傾注干板，凝固后備用。 冷卻至 50℃ 左右，傾注平板。 加熱攪拌至溶解。 待冷至 5060℃ 時，每 100ml 培養(yǎng)基中加入乳糖 l g及滅菌的 1％中性紅水溶液 ml，混合后窮傾注平板。 將瓊脂加于余下的 500 mi水中加熱溶解。 IsoVitaleX 添加物 Vit B12 g L 一谷氨酰胺 腺嘌呤 鹽酸鳥嘌呤 L 一胱氨酸 (先溶于 lmol／ L NaOH) P 一氨基苯甲酸 g 葡萄糖 100g 輔酶 1 g 脫羧輔酶 g 硝酸鐵 鹽酸硫胺素 鹽酸半胱氨酸 蒸餾水 1000ml 過濾除菌，分裝備用。 滅菌后冷至 50℃ 左右混合成 2020ml，使血紅素終濃度為 1％。 稱 20g 血紅素 (hemoglobin， Difco)溶于 1000 ml冷蒸餾水中，務(wù)必混合均勻，否則滅菌后會有顆粒殘留。 取出并冷卻至 50℃ 左右，傾注平板，經(jīng)無菌試驗后存冰箱內(nèi)備用。 巧克力平板 配方一 [成分 ]：與血瓊脂平板配方一相同。 冷卻至 50℃ 左右，以無菌手續(xù)加入無菌脫纖維羊血 (臨用前置 37℃ 水浴預溫 )8～ 10ml／ 100ml，輕輕搖勻 (勿使有氣泡 )傾注于 滅菌平皿內(nèi)，每一平皿 (直徑 9cm)13— 15ml。 加熱攪拌至完全溶解，調(diào)正 pH 至 。 待凝固后，抽樣于 37℃ 培養(yǎng) 1 日～ 24 小時行無菌試驗，如無細菌生長置冰箱中備用。 用中段尿做厭氧菌培養(yǎng) 附錄 血瓊脂平板 配方一 [成分 ] 普通瓊脂 100ml 無菌脫纖維綿羊血 8— l0ml [制法 ]： 將已滅菌的無菌普通瓊脂 (Ph 7． 6)隔水加熱融化。 使用留取時間 超過 2 小時，或冷藏時間超過 8 小時的標本進行接種。 l、將尿液標本接種于增菌液中。 不同種類的細菌生長速度不同、營養(yǎng)要求不同，菌落計數(shù)有所不同。 尿頻時，膀胱內(nèi)細菌停留時間短。 尿液稀釋，尿比重 ，營養(yǎng)成分減少，使細菌發(fā)育遲緩。以下情況可使尿液中細菌數(shù)量減少，結(jié)果判斷時應(yīng)予以注意。并且在一些病人即使菌落數(shù)較少，也有明顯的臨床意義。不同的培養(yǎng)基有助于分離不同種類的細菌，所以不能以血平板代替“規(guī)范”中規(guī)定的中國蘭、麥康凱和巧克力平板。l 的無菌微量移液器吸取尿液加入平板上，再使用接種環(huán)劃線。也可使用 l181。定量接種的方法有直接劃線法和傾注平板法兩種，后者由于操作步驟繁瑣，已幾乎不被臨床單位使用。清潔中段尿是最常用獲得尿培養(yǎng)標本的方法，但在留取標本前須向病人詳細說明標本的留取方法和注意事項，以保證留取標本的質(zhì)量，同時對檢驗結(jié)果應(yīng)進行正確評價。 (3)有意義的陽性結(jié)果報告：報告菌落計數(shù)、細菌種名及藥敏結(jié)果。僅報告“無菌 生長”是不正確的。1 無菌生長 (1000CFU／ m1)”，或“接種 100181。 (五 )結(jié)果報告 l、初步報告：在分離出細菌后，根據(jù)其在培養(yǎng)基中的生長結(jié)果，做革蘭染色，并做出初步報告。 實驗室 主 題 文件編號 W002 廣東省汕尾逸輝基金醫(yī)院 檢驗科臨床微生物室 尿路感染細菌學 檢查規(guī)范 第 17 頁 共 137 頁 第 1 版 第 0次修改 撰寫日期： 2020． 05． 10． 起 草 人 操 作 人 批 準 人 生效日期 (四 )細 菌鑒定和藥敏試驗 對于菌落計數(shù)結(jié)果有意義的臨床分離菌均需要鑒定到種并進行藥敏試驗。 104 純培養(yǎng)有意義，需進行鑒定和藥敏；混合菌生長無明確意義僅做革蘭染色鏡檢 105 純培養(yǎng)或混合菌生長某一種菌落數(shù)≥ 105 者有意義需進行鑒定和藥敏， 導尿 103 3 種菌以內(nèi)都有意義需進行鑒定和藥敏， 恥骨上膀胱穿刺 任意數(shù)目 所有細菌都有意義需做鑒定和藥敏， 注：清潔中段尿和導尿的標本有 4 種以上微生物生長均報告標本污染。 不同來源標本結(jié)果解釋 (見表 1) 表 l 不同來源標本結(jié)果解釋及實驗室處理方法 標本來源 菌落數(shù) CFU／ m1 結(jié) 果解釋及實驗室處理 清潔中段尿 5179。1 接種量者，將平板菌落數(shù)乘以 102(CFU／ m1)。 (三 )結(jié)果觀察和結(jié)果解釋 菌落計數(shù)： (1)采用 10181。對臨床要求真菌、淋病奈瑟菌及結(jié)核桿菌培養(yǎng)者，可參照有關(guān)章節(jié)選擇接種相應(yīng)的特殊培養(yǎng)基進行培養(yǎng)。l接種量。l 接種于血平板和麥康凱平板或中國蘭平板， 3537℃培養(yǎng) 18～24h。 (二 )培養(yǎng)基選擇和標本接種 根據(jù)標本來源及臨床診斷選擇適合的 培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件。 根據(jù)標本采集時間、所用容器確定標本是否合格。 三、實驗室檢查 (一 )標本的驗收 工作人員應(yīng)首先檢查化驗單所提供的信息，信息應(yīng)包括：標本收集時間、標本收集方式、病人是否已使用抗生素等。 其他方法 收集特定部位的尿標本可以通過侵入的方式如膀胱鏡或手術(shù)中進行采集。 留置導尿 利用留置導尿管采集標本時，應(yīng)先消毒導尿管外部，按無菌操作方法用注射器通過導尿管吸取尿液，操作時注意防止混入消毒劑。 小兒收集包 對于無自控能力的小兒可應(yīng)用收 集包收集尿液，這種裝置由于很難避免會陰部菌群污染尿液而產(chǎn)生假陽性，所以只有在檢驗結(jié)果為陰性時才有意義?？蓽p少尿液標本污染，準確地反映膀胱感染情況。該方法是評估膀胱內(nèi)細菌感染的“金標準”。 (3)前段尿排去，將中段尿約 10/20ml直接排入專用的無菌容器中。 清潔中段尿 是最常用獲得尿培養(yǎng)標本的方法 (該方法很難使尿標本做到不被污染，需對結(jié)果進行合理評價 )。 二、標本采集和運送 (一 )容器： l、由不與尿液成份發(fā)生反應(yīng)的惰性材料制成； 潔凈、無菌、加蓋、密封、防滲漏； 不含防腐劑和抑菌劑，一次性使用； 容積應(yīng) 50ml、開口 — 直徑應(yīng) 4cm、具有較寬的底部、盒蓋易于開啟?？梢蚧颊叩哪挲g和健康情況而不同，新生兒尿路感染的癥狀往往是非特異性的、模糊的，可表現(xiàn)有厭食，嘔吐，倦怠，無發(fā)熱的菌血癥等；嬰兒期直到 2 歲，常有高熱； 2 歲以后的尿路感染才會有典型的臨床表現(xiàn)；老年患者的尿路感 染常缺乏明顯的癥狀，更易造成菌血癥和 急性腎功能衰竭。 淋巴管感染：更為少見，當盆腔器官炎癥、闌尾炎和結(jié)腸炎時，細菌可經(jīng)淋巴管引起腎盂腎炎。常見的病原菌有葡萄球菌、傷寒沙門菌、念珠菌和結(jié)核分枝桿菌等。 血行感染：是一種比較少見的感染方式。這種方式引起的感染多為單一細菌感染，大腸埃希菌是主要致病菌，其次是克雷伯菌屬和變形桿菌屬 (后兩者遠遠少于前者 )，有時也會發(fā)生混合感染。 (三 )發(fā)病機理及常見致病菌 上行感染：腸道菌群逆行感染是泌尿系感染最常見的方式。不同部位同時感染也很常見。尿路感染并非是一種單一的疾病，而是一種臨床綜合癥。從