蛋白質(zhì)研究技術(shù)平臺(參考版)
2025-05-05 05:27本頁面
【正文】 Western blot常見問題 Western blot結(jié)果如何分析 目的蛋白 110kd 。 膠的均勻度，膠越均勻，條帶越窄，分離越均勻。 Western blot常見問題 ? 怎樣才能把膠跑的非常漂亮，泳道和 band都能很直 ? ? 影響跑膠跑的質(zhì)量，有以下幾個因素： 電壓，小的電壓會使膠的分子篩效應(yīng)得到充分發(fā)揮。干轉(zhuǎn)的話，用 A/cm2， 30min就應(yīng)該夠了。太大時還可以考慮用瓊脂糖膠；提高轉(zhuǎn)移電壓／電流；增加轉(zhuǎn)移時間。 ?在做 Western Blot時， PBDF膜用甲醇浸泡的目的？ ?解答： PVDF膜用甲醇泡的目的是為了活化PVDF膜上面的正電基團，使它更容易跟帶負電的蛋白質(zhì)結(jié)合，做小分子的蛋白轉(zhuǎn)移時多加甲醇也是這個目的。如果抗體識別的是蛋白上連續(xù)的幾個氨基酸，也就是 線性表位 ，那么這種抗體可同時用于免疫組化和 Western，而如果抗體識別 構(gòu)象形表位 ，則只能用于免疫組化。把膜保存在－ 20℃ 以備以后使用。 ? 封閉： 膜加封閉液（ 5％脫脂牛奶 in TBST） , 室溫 1h. ? 抗體孵育： 加一抗（ 1： 1000） 4℃ 孵育過夜， TBST洗三次，3x10min；加二抗（ 1： 20220） 室溫 1h， TBST洗三次，3x10min； ? 顯影： 膜上加同體積 ECL A， B液（ 100181。g蛋白量上樣，電泳至溴酚蘭跑到底部。HCl（ ） － mol/L Tris ? 6. 根據(jù)標準曲線計算出樣品中的蛋白濃度。 ? 4. 各孔加入 200微升 G250染色液，室溫放置 35分鐘。 ? 標準品 按 0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20微升分別加到 96孔板中，加標準品稀釋液 補足到 20微升 。 標準曲線有輕微的非線性 BCA法 靈敏度非常高20～ 200mg,微量BCA為 ～10mg 較快速 ,40分鐘內(nèi) 在堿性環(huán)境下蛋白質(zhì)與 Cu2+絡(luò)合并將 Cu2+還原成 Cu1+ 螯合劑；略高濃度的還原劑 抗干擾能力強，蛋白不可逆的變性 蛋白質(zhì)測定方法比較 蛋白質(zhì)濃度測定 ? Bradford法測定蛋白質(zhì)濃度 ? 試劑 G250考馬斯亮藍溶液： mol/L NaCl：
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