【正文】 培養(yǎng)時間宜 48h 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 123 ? 實(shí)用時應(yīng)按說明書配制，注意 pH值是否符合規(guī)定，必要時應(yīng)校正 pH后滅菌使用 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 124 謝謝！ 。 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 120 不能報(bào)告的情況 ? 陰性對照有菌生長或陽性對照試驗(yàn)呈陰性結(jié)果，試驗(yàn)結(jié)果無效 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 121 6 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 122 典型菌落特征 ? 金黃色葡萄球菌在上述三種分離培養(yǎng)基上的典型菌落為金黃色。目前商品化的凝固酶試劑多家微生物相關(guān)制劑公司有售，試劑具有較好的穩(wěn)定性、準(zhǔn)確性 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 118 4 初步生化試驗(yàn)見下表 性狀 金黃色葡萄球菌 表皮葡萄球菌 腐生葡萄球菌 菌落色素 主要為金黃色 主要為白色 主要為檸檬色 大小 (菌落直徑 ) ～ ～ ～ α 溶血毒素 + /極少 + 甘露醇 需氧 + d d 厭氧 + 凝固酶 + 卵黃反應(yīng) + 耐熱 DNA酶 + 對新生霉素敏感性 S S R 噬菌體分型 多數(shù)能分型 不能分型 不能分型 A蛋白 + 致病性 強(qiáng) 弱或無 無 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 119 5 ? 當(dāng)陰性對照試驗(yàn)呈陰性，陽性對照試驗(yàn)呈陽性結(jié)果，供試品培養(yǎng)物按下列情況報(bào)告或處理： ? 革蘭陽性球菌，血漿凝固酶試驗(yàn)陽性反應(yīng)者，報(bào)告 1g或 1ml供試品檢出金黃色葡萄球菌（少許菌株可能不是金黃色葡萄球菌而是葡萄球菌屬的其他菌種）。檢查時，輕輕將試管傾斜， (動作勿大 )仔細(xì)觀察，陰性對照管血漿流動自如，陽性對照管液呈凝固狀，試驗(yàn)管液呈凝固者為陽性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。三管同時置 36177。 1℃ 培養(yǎng) 18～ 24h，取其培養(yǎng)物作革蘭染色、鏡檢及血漿凝固酶試驗(yàn) 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 116 初步鑒別試驗(yàn)： ? 革蘭染色、鏡檢金黃色葡萄球菌為革蘭陽性球菌，無芽孢，一般不產(chǎn)生莢膜。當(dāng)陽性對照平板呈典型菌落生長時，供試品分離平板無菌落生長，或有菌落生長但不同于所列特征，可報(bào)告為 1g或1ml供試品未檢出金黃色葡萄球菌 ? 1所列特征相似的典型形態(tài)，應(yīng)挑取該菌落作純培養(yǎng)，對非典型形態(tài)的菌落，可增加血瓊脂平板分離鑒別。 1℃ 培養(yǎng) 18～ 24h(必要時可延至48h) 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 113 分離培養(yǎng) ? 將上述供試品增菌培養(yǎng)液及陽性對照增菌液輕輕1～ 2環(huán)培養(yǎng)液，劃線接種于卵黃氯化鈉瓊脂平板或甘露醇氯化鈉瓊脂平板上，置 36℃ 177。常見有金黃色葡萄球菌與表皮葡萄球菌、腐生葡萄 ? 金黃色葡萄球菌檢查按增菌、分離、純培養(yǎng)、革蘭染色鏡檢和血漿凝固酶試驗(yàn)等步驟進(jìn)行 ? 本法適用于外用藥品及一般滴眼劑、眼膏劑的檢查 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 110 2 ? 金黃色葡萄球菌［ CMCC(B)26003］ ? 營養(yǎng)瓊脂斜面新鮮培養(yǎng)物少許，接種至 5ml營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基中， 36℃ 177。 1℃ 培養(yǎng) 24h ? 取出放入冰箱內(nèi) 10～ 30min ? 如培養(yǎng)基呈溶液狀，即為明膠液化試驗(yàn)陽性反應(yīng)；如明膠呈凝固狀，為陰性反應(yīng) 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 101 ? (1) 本試驗(yàn)接種前，培養(yǎng)基應(yīng)為固態(tài)，否則需將培養(yǎng)基置冰箱內(nèi)使之凝固后，再穿刺接種 ? (2) 試驗(yàn)應(yīng)同時設(shè)未接種細(xì)菌的陰性對照管，與試驗(yàn)管同時培養(yǎng)并觀察結(jié)果 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 102 5 ? 供試品培養(yǎng)物經(jīng)證實(shí)為革蘭陰性桿菌，氧化酶試驗(yàn)及綠膿菌素試驗(yàn)皆為陽性者，即報(bào)告 1g或1ml供試品檢出銅綠假單胞菌 ? 供試品培養(yǎng)物氧化酶試驗(yàn)陽性，鏡檢為革蘭陰性桿菌的培養(yǎng)物，綠膿菌素試驗(yàn)陰性時，其硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn)、 41℃ 生長試驗(yàn)及明膠液化試驗(yàn)皆為陽性時，亦報(bào)告 1g或 1ml供試品檢出銅綠假單胞菌 ? 凡與 1g或 1ml供試品未檢出銅綠假單胞菌 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 103 ? 也可以采用自動化菌種鑒定系統(tǒng)進(jìn)行菌種鑒定，對疑似菌落如果鑒定為銅綠假單胞菌可以報(bào)告從供試品中檢出銅綠假單胞菌 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 104 6 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 105 ? 銅綠假單胞菌污染藥品后，因生產(chǎn)工藝和藥物的影響，在溴代十六烷基三甲胺平板上的菌落形態(tài)可產(chǎn)生非典型形態(tài)。如果在培養(yǎng)基內(nèi)的小倒管中有氣體產(chǎn)生，即為陽性反應(yīng)，表明該培養(yǎng)物能還原硝酸鹽，并將亞硝酸鹽分解產(chǎn)生氮?dú)狻?1℃ 的恒溫水浴箱內(nèi)，務(wù)使整個斜面浸沒在水浴中，培養(yǎng) 24～ 48h，斜面如有菌苔生長者為陽性反應(yīng)；無菌苔生長為陰性反應(yīng) 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 98 4 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 99 硝酸鹽還原產(chǎn)氣試驗(yàn) ? 以接種環(huán)沾取少許營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于硝酸鹽胨水培養(yǎng)基中，置 36177。如培養(yǎng)基斜面無色素產(chǎn)生，應(yīng)于室溫培養(yǎng) 1～ 2天再按上法試驗(yàn)。使培養(yǎng)物中的色素完全萃取在氯仿液內(nèi)。當(dāng)陽性對照平板無菌落生長或生長菌落經(jīng)檢查不是銅綠假單胞菌，應(yīng)研究原因，重新試驗(yàn)或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 94 純培養(yǎng) ? 供試品分離平板生長 疑似菌落時，以接種針輕輕接觸單個菌落的表面中心，沾取培養(yǎng)物，應(yīng)挑取 2～ 3個疑似菌落，分別接種營養(yǎng)瓊脂斜面，培養(yǎng)，作以下檢查 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 95 初步鑒別試驗(yàn) ? 革蘭染色鏡檢銅綠假單胞菌為革蘭陰性、無芽孢桿菌，單個，成對或成短鏈排列 ? 氧化酶試驗(yàn)：銅綠假單胞菌呈陽性 ? 綠膿菌素試驗(yàn) ? 42℃ 生長試驗(yàn) 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 96 綠膿菌素試驗(yàn) ? 取營養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物接種于綠膿菌素測定用培養(yǎng)基 (PDP)斜面上， 36177。菌落周圍常有水溶性藍(lán)綠色素?cái)U(kuò)散，使培養(yǎng)基顯藍(lán)綠色，但亦有不產(chǎn)色素的菌株。 1℃ 培養(yǎng) 18～ 24h(必要時可延至 48h) 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 93 分離培養(yǎng) ? 增菌培養(yǎng)液 1～ 2環(huán) (如有菌膜應(yīng)挑取之 )，劃線接種于溴代十六烷基三甲胺瓊脂平板 ? 于 36177。 1℃ 培養(yǎng) 18～ 24h后，用 %無菌氯化鈉溶液稀釋至 1： 106，使對照菌加入量含 50～ 100個 cfu (一般用量為)，菌數(shù)在做陽性對照實(shí)驗(yàn)的同時用營養(yǎng)瓊脂平板涂布經(jīng)培養(yǎng)后計(jì)數(shù)確定 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 91 3 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 92 增菌培養(yǎng) ? 取膽鹽乳糖培養(yǎng)基 3瓶，每瓶 100ml， 2瓶分別加入 1： 10供試液 10ml(相當(dāng)于供試品 1g或 1ml)，其中一瓶加入含對照菌 50～ 100個菌落形成單位的菌液作為陽性對照。所有用過的增菌、分離、生化試驗(yàn)培養(yǎng)基、血清學(xué)凝集試驗(yàn)及染色鏡檢后的玻片等，均需經(jīng)滅菌后方能洗滌 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 88 三、銅綠假單胞菌檢查法 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 89 1 ? 銅綠假單胞菌，習(xí)稱綠膿桿菌，為假單胞菌屬菌種 ? 廣泛分布在土壤，水及空氣，人和動物的皮膚、腸道、呼吸道均有存在，故可通過環(huán)境和生產(chǎn)的各個環(huán)節(jié)污染藥品。由于本法試驗(yàn)用多價血清，其凝集力相對較弱，試驗(yàn)用菌液量切不能過大。 2h，時間過短過長，都可能出現(xiàn)錯誤結(jié)果判斷。如遇血清學(xué)凝集試驗(yàn)陽性時而生化試驗(yàn)不符合，應(yīng)首先檢查培養(yǎng)物的純度。在進(jìn)行陽性菌對照試驗(yàn)時，應(yīng)與供試品檢驗(yàn)分開操作，避免污染。分離平板在使用前應(yīng)置 36℃ 溫箱內(nèi)倒置孵育 1～ 2h，使其表面溫暖濕潤，利于分離 2022年 4月 16日星期六 中國藥品生物制品鑒定所抗生素室 83 ? 在對供試品進(jìn)行測試的同時，需做陽性菌對照及