【正文】 六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 14 6 凝固酶試驗(yàn)操作方法 ? 無菌試管 (10 100mm)3支，加入血漿和%無菌氯化鈉溶液 (1： 1) 各 ， 1支加入被檢菌的營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液，作為檢品管；其余 2支作對(duì)照管： 1支加入金黃色葡萄球菌［ CMCC(B)26003］營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)液或菌懸液 照；另一支加入營(yíng)養(yǎng)肉湯或 %無菌氯化鈉溶液 ? 三管同時(shí)置 36177。如用陳舊培養(yǎng)物及血漿 (纖維蛋白常已析出 )易導(dǎo)致假陰性反應(yīng) ? 用試管法檢查時(shí)，輕輕將試管傾斜，(動(dòng)作勿大，防止江凝塊搖碎 )仔細(xì)觀察 ? 試驗(yàn)時(shí)間過長(zhǎng)容易導(dǎo)致假陰性 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 16 6 凝固酶試驗(yàn)的結(jié)果判定 ? 陰性對(duì)照管血漿流動(dòng)自如，陽性對(duì)照管液呈凝固狀，試驗(yàn)管液呈凝固者為陽性反應(yīng)；不凝固為陰性反應(yīng)。埃希菌屬除大腸埃希菌外，還有蟑螂埃希菌等四個(gè)種 ? 大腸埃希菌是人和溫血?jiǎng)游锬c道內(nèi)的棲居菌，隨糞便排出體外。為保證人體健康，口服藥品必須檢查大腸桿菌 ? 大腸埃希菌除普通大腸桿菌外尚有致病性大腸桿菌、產(chǎn)毒性大腸桿菌、溶血性大腸桿菌、侵襲性大腸桿菌等，可引起嬰幼兒、成人爆發(fā)性腹瀉、結(jié)膜炎等病癥 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 23 2 ? 菌種為大腸桿菌［ＣＭＣＣ（Ｂ） 44102］ ? 對(duì)照菌液加入量含菌 50～ 100cfu（一般用量為 ） ? 制作方法：營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物少許，接種至5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)， 36177。陰性對(duì)照應(yīng)無菌生長(zhǎng)。單一的 MUG鑒別大腸桿菌其漏檢率達(dá) 6％，鑒于 98％的大腸桿菌靛基質(zhì)試驗(yàn)為陽性，故將 MUG，靛基質(zhì)試驗(yàn)結(jié)合，用 EMB瓊脂平板分離，輔以 IMViC試驗(yàn)，在理論上可使大腸桿菌的檢出率達(dá) 99％ ? 由于熒光反應(yīng)的敏感度較顏色反應(yīng)強(qiáng)千萬倍，易于觀察，沒有主觀性，因而用 MUG鑒定大腸桿菌已被廣泛應(yīng)用于臨床、食品、飲水、污水等的檢測(cè) ? MUG陽性（有熒光）、靛基質(zhì)陽性（玫瑰紅色） ,MUG陰性（無熒光）、靛基質(zhì)陰性（無色） ? 如 MUG、 I試驗(yàn)為陽性或陰性即可報(bào)告結(jié)果，如 MUG與 I試驗(yàn)不一致時(shí)，則需分離培養(yǎng)、革蘭染色、鏡檢及生化試驗(yàn)鑒別 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 27 MUG試驗(yàn)操作 ? 以滅菌吸管取供試品膽鹽乳糖增菌培養(yǎng)液、供試品陽性對(duì)照培養(yǎng)液、陰性對(duì)照培養(yǎng)液各 ，分別加入 MUG－蛋白胨培養(yǎng)基（培養(yǎng)基 ）管， 37℃ 培養(yǎng) 24h后，將各管置 366nm紫外燈下觀察有無藍(lán)白色熒光，然后加歐波試液 4～ 5滴于上述 MUG管內(nèi)，觀察液面顏色 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 28 MUG法不必分離單個(gè)菌落 ? 除大腸埃希菌外，尚有部分志賀菌屬、沙門菌屬的菌株；以及少數(shù)革蘭陽性球菌、桿菌和芽孢菌，其 MUG為陽性 ? 在 MUG培養(yǎng)基成分中增加了去氧膽酸鈉，可排除革蘭陽性菌的干擾 ? 志賀菌、沙門菌在膽鹽乳糖培養(yǎng)基中較難生長(zhǎng)，即使有生長(zhǎng)，本法能檢出。供試品 MUG管是否有熒光，應(yīng)仔細(xì)觀察比較，或?qū)⒏鞴苷{(diào)換位置（陰性管居中），適當(dāng)傾斜試管。當(dāng)陽性對(duì)照的平板呈典型菌落生長(zhǎng)時(shí)，供試品分離平板無菌落生長(zhǎng)，或有菌落但不同于下表所列特征，可判為供試品 1g或 1ml未檢出大腸桿菌 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 33 大腸桿菌在不同培養(yǎng)基上 菌落形態(tài)特征 ? 當(dāng)陽性菌對(duì)照平板未生長(zhǎng)或生長(zhǎng)菌落經(jīng)檢查不是大腸桿菌，應(yīng)研究原因，重新試驗(yàn)或重新制備供試液，以消除供試品抑菌成分的影響。 非典型菌落呈淺紫色 、 粉紅色 ， 或菌落中心紫色或無明顯暗色中心 ， 無金屬光澤 。 非典型菌落呈微紅色 ， 或菌落中心呈紅色 。絕大多數(shù)遲緩發(fā)酵乳糖的細(xì)菌，可于 24h出現(xiàn)陽性。 ? 陰性培養(yǎng)物的進(jìn)一步檢查：一般 24h即可出現(xiàn)陽性結(jié)果，以無菌操作先從管中取出 1或2ml培養(yǎng)液進(jìn)行檢查，如靛基質(zhì)是陰性，余下的蛋白胨水培養(yǎng)物再培養(yǎng) 24h，作試驗(yàn) 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 39 ? 操作：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 48177。 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 40 （ VP） ? 操作：取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)物，接種于磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中，培養(yǎng) 48177。僅培養(yǎng) 2天是不夠的，故試驗(yàn)培養(yǎng)時(shí)間改為 2～ 4 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 42 5 ? 當(dāng)陰性對(duì)照試驗(yàn)呈陰性，陽性對(duì)照試驗(yàn) MUG呈陽性，供試品 MUG陽性、靛基質(zhì)陽性，報(bào)告 lg或1ml供試品檢出大腸桿菌。 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 44 ? 試驗(yàn)操作應(yīng)當(dāng)嚴(yán)格按照相關(guān)要求進(jìn)行 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 45 IMViC試驗(yàn)的順序 ? 以滅菌接種針沾取菌苔，首先接種于枸櫞酸鹽瓊脂斜面上，然后接種于蛋白胨水培養(yǎng)基、磷酸鹽葡萄糖胨水培養(yǎng)基中。陽性對(duì)照菌液的制備、計(jì)數(shù)及加入含供試品的培養(yǎng)基中等操作，不能在檢測(cè)供試品的無菌室或凈化臺(tái)上進(jìn)行，必須在單獨(dú)的隔離間或凈化臺(tái) 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 47 ? 在各類供試品中檢測(cè)大腸桿菌及其他控制菌，按一次檢出結(jié)果為準(zhǔn)，不再抽樣復(fù)驗(yàn)。利用乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣者進(jìn)行進(jìn)一步鑒別 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 49 大腸菌群菌落形態(tài)特征 ? 菌落疑似者再進(jìn)行確證試驗(yàn) ? 菌落接種到膽鹽乳糖發(fā)酵管，產(chǎn)酸產(chǎn)氣報(bào)告檢出大腸菌群，否則判未檢出 培養(yǎng)基 菌落形態(tài) 曙紅亞甲藍(lán)瓊脂 呈紫黑色 、 紫紅色 、 紅色或者粉紅色 ， 圓形 ， 扁平或稍凸起 ， 邊緣整齊 ， 表面光滑 ，濕潤(rùn) 。 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 50 大腸菌群數(shù)的推算 各供試品量的檢出結(jié)果 可能的大腸菌群數(shù) N（ cfu/g(ml) () (l) (1ml) + + + 103 + + 102N103 + 10N102 10 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 51 二、沙門菌檢查法 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 52 1 ? 腸桿菌科的重要致病菌 ? 2022年出版的第八版的臨床微生物手冊(cè)將沙門菌屬分成兩個(gè)菌種。由于沙門菌血清型繁多，各血清型的生化 及血清學(xué) 特性雖密切相關(guān)，卻不盡相同，采用一種增菌培養(yǎng)基和兩種分離培養(yǎng)基，不可能涵蓋所有沙門菌的最適增菌及分離條件 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 53 藥物對(duì)沙門菌的影響 ? 此外，由于藥品在生產(chǎn)過程中，常受到加熱、干燥等加工步驟的影響，藥品中污染的沙門菌可受到損傷或呈休眠狀態(tài)，故須在增菌培養(yǎng)前先進(jìn)行預(yù)增菌。其他控制菌也可能存在相同狀況 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 54 2 對(duì)照用菌液 ? 乙型副傷寒沙門菌 〔 CMCC(B)50094〕 的營(yíng)養(yǎng)瓊脂 ? 斜面培養(yǎng)物少許，接種至 5ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基內(nèi)。 1℃ 培養(yǎng) 18～ 24h后，用 %無菌氯化鈉溶液釋至 1： 106，濃度相當(dāng)于 50100個(gè) cfu/ 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 55 3 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 56 ? 預(yù)增菌 取營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基 3瓶，每瓶各100ml， 2瓶加入 1： 10供試液各 10ml，其中 1瓶加入對(duì)照菌液 (含菌量為 50～ 100個(gè) cfu/ml)作陽性對(duì)照，第 3瓶加入稀釋劑 10ml作陰性對(duì)照，培養(yǎng) 18～ 24h后觀察。陽性對(duì)照管 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 57 分離培養(yǎng) ? 輕微搖動(dòng)供試品增菌培養(yǎng)瓶和陽性對(duì)照增菌培養(yǎng)瓶，以接種環(huán)分別沾取 1～ 2環(huán)培養(yǎng)液接種于膽鹽硫乳瓊脂 (DHL)或沙門菌志賀菌瓊脂 (SS)平板及曙紅亞甲藍(lán) (EMB)瓊脂或麥康凱瓊脂平板各 1個(gè)，倒置培養(yǎng) 24～ 48h。 同一平板上常有多數(shù)菌落無黑色中心 同膽鹽硫乳瓊脂平板 。 遲緩發(fā)酵乳糖或不發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬 ⅠⅡⅣⅤ 同 (MacC) 同曙紅亞甲藍(lán)瓊脂平板 發(fā)酵乳糖的菌株菌落為粉紅色 ，不發(fā)酵乳糖或遲緩發(fā)酵乳糖的菌株與沙門菌亞屬 ⅠⅡⅣⅤ 同 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 59 菌落特征補(bǔ)充 ? 由于沙門菌不發(fā)酵乳糖和蔗糖，不產(chǎn)酸，菌落不著色，一般為無色半透明，多數(shù)沙門菌因產(chǎn)生 H2S，菌落中心呈現(xiàn)黑色甚至全黑色，在 DHL瓊脂平板上較為明顯 ? 在 SS瓊脂平板上， H2S特征有時(shí)不明顯，沙門菌屬亞屬 Ⅲ因多數(shù)菌株發(fā)酵乳糖，故在上述平板上的乳糖發(fā)酵菌落呈現(xiàn)粉紅或紫色，但由于產(chǎn)生 H2S，在有 H2S指示系統(tǒng)的平板上仍出現(xiàn)黑色中心 ? 在上述培養(yǎng)基上，有些非沙門菌屬細(xì)菌，也可呈現(xiàn)類似沙門菌菌落形態(tài)，須進(jìn)一步鑒別 ? 陽性對(duì)照平板上，應(yīng)有沙門菌落形態(tài)特征的菌落生長(zhǎng)，否則，應(yīng)查明原因。 2h，觀察結(jié)果 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 62 4 2022年 4月 16日星期六 中國(guó)藥品生物制品鑒定所抗生素室 63 三糖鐵瓊脂反應(yīng) ? 疑似沙門菌在三糖鐵瓊脂斜面上的反應(yīng) ? ①斜面紅色 (產(chǎn)堿 )，底層黑色 (產(chǎn) H2S)并顯示黃色 (產(chǎn)酸 )； ? ②斜面紅色，底層黃色； ? ③斜面黃色，底層黑色，并顯示黃色。 ? 對(duì)在三糖鐵瓊脂斜面黃色并同時(shí)底層無黑色，或