【正文】 天然浸出液的適宜保藏瓊脂斜面上 。 將認(rèn)為有希望的菌落用牙簽轉(zhuǎn)接到另一模擬分離瓊脂平板上進(jìn)行篩選 。 ? 所采集的樣本應(yīng)具有一定的代表性 。 (二 )生態(tài)學(xué)參數(shù) ? 放線菌分離培養(yǎng)過(guò)程中所需考慮的生態(tài)參數(shù)有溫度 、 pH、 離子強(qiáng)度 、 氧化還原電勢(shì)和底物濃度 。 除嗜溫性放線菌外 ， 其他放線菌一般在培養(yǎng) 420天內(nèi)在分離平板上緩慢形成菌落 。 ? 選擇性地添加抗生素 。 放線菌的分離 ? 土樣中放線菌的非選擇性分離：土樣風(fēng)干，磨碎，無(wú)菌海綿壓印土樣后壓印平板后培養(yǎng)。也可洗下微生物后振蕩培養(yǎng)。 次代培養(yǎng)及純化 ? 菌落形成后可根據(jù)肉眼可見的菌落形態(tài)上的差異 ，作初步的鑒定和區(qū)分 。 ? 成功地分離出各種不同的放線菌屬及種的關(guān)鍵是所采集樣本的本身及其分離用的瓊脂培養(yǎng)基；而肉眼識(shí)別不同的生長(zhǎng)形態(tài) 、 從而初步地加以鑒定 ，在分離放線菌時(shí)顯得尤為重要 。 六 、真菌分離 利用低碳／氮比的培養(yǎng)基可使真菌生長(zhǎng)菌落分散 ， 利于計(jì)數(shù) ， 分離和鑒定 。 改變培養(yǎng)溫度將有利于不同嗜溫區(qū)真菌的分離 。 選擇性富集：是通過(guò)一定的方式使樣本中一種或一群微生物數(shù)量上的增加而利于分離的一種技術(shù)。 選擇性抑制培養(yǎng)基可使非目標(biāo)微生物消除或減少到一定程度。 真菌的分離方法 ? 土中真菌的分離：稀釋法 ， 混入法 ， 壓貼法 ，粘附法 ， 浮選法 ， 注射器采集法 ， 土過(guò)篩法 ，庶糖密度梯度離心法 。 ? 水中真菌的分離：水樣稀釋后涂布分離 。 ? 子實(shí)體直接分離培養(yǎng)擔(dān)子菌：新采集的子實(shí)體組織植入平板內(nèi)或在放于液體培養(yǎng)基表面放一小塊無(wú)菌濾紙上培養(yǎng) 。 進(jìn)行類似新種篩選分離 ， 達(dá)到獲得新的優(yōu)良生產(chǎn)菌種的目的 。 通過(guò)改造 ， 可使現(xiàn)存的優(yōu)良性狀強(qiáng)化 ， 或去除不良性質(zhì)或增加新的性狀 。 ? (2)希望基因型的選出 。 選擇育種方法時(shí)綜合考慮的因素 (1)待改良性狀的本質(zhì)及與發(fā)酵工藝的關(guān)系 (如批式或連續(xù)發(fā)酵試驗(yàn) )； (2)對(duì)這一特定菌種的遺傳和生物化學(xué)萬(wàn)面認(rèn)識(shí)的明了程度； (3)經(jīng)濟(jì)費(fèi)用 。 工業(yè)菌種改良方法 (1)解除或繞過(guò)代謝途徑中的限速步驟：通過(guò)增加特定基因的拷貝數(shù)或增加相應(yīng)基因的表達(dá)能力來(lái)提高限速酶的含量；在代謝裔途徑中引伸出新的代謝步驟 ， 由此提供一個(gè)旁路代謝途徑 。 (3)改變代謝途徑 ， 減少無(wú)用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物 、 前體或產(chǎn)品的耐受力 。 (5)改進(jìn)菌種外泌產(chǎn)品的能力 。 如誘導(dǎo)代謝產(chǎn)品的結(jié)構(gòu)類似物抗性 。 ? (2)誘導(dǎo)解除基因表達(dá)抑制的突變 。 ? b. 由另一菌株的高效低能代謝途徑代謝來(lái)實(shí)現(xiàn) 。 第四節(jié) 誘變育種 ? 以微生物的自然變異作為基礎(chǔ)的生產(chǎn)選種的機(jī)率并不很高 ， 一個(gè)基因的自然突變頻率僅 1061010左右 。 誘變 物理、化學(xué)或生物誘變方法 一、誘變劑和誘變處理 ? 物理誘變劑：射線如紫外線 、 X— 射線 、 γ—射線 ， 快中子； ? 物理因素中目前使用得最方便而且十分有效的是紫外線 。 ? 其他的幾種射線都是電離性質(zhì)的 ， 有一定的穿透力 ， 一般都由專業(yè)人員在專門的設(shè)備中使用 ，否則有一定危險(xiǎn)性 。 化學(xué)誘變劑中使用最多 、 最有效的是烷化劑 。 化學(xué)誘變劑是很經(jīng)濟(jì)的 ， 因?yàn)橹恍枰倭康暮线m的誘變劑 ， 設(shè)備是實(shí)驗(yàn)室的一般玻璃器皿 ，一個(gè)蒸氣罩 。 行工作時(shí) ， 設(shè)備費(fèi)用大 ， 并要注意安全性 。 誘變劑的選擇 1． 堿基類似物和羥胺具有很高的特異性 ， 但很少使用 ， 回復(fù)突變率高 ， 效果不大 。 其中亞硝基胍和甲基磺酸乙酯常被稱為“ 超誘變劑 ” ， 甲基磺酸乙酯是毒性最小的誘變劑之一 。 4． 紫外線仍十分有效 。 但它可能影響鄰近基因的性能 。 2． 在生產(chǎn)中經(jīng)生產(chǎn)選種得到的菌株與野生型較相像 ， 也是良好的出發(fā)菌株 。 4． 出發(fā)菌株開始時(shí)可以同時(shí)選 2～ 3株 ， 在處理比較后 ， 將更適合的出發(fā)菌株留作繼續(xù)誘變 。 6．根據(jù)采用的誘變劑或根據(jù)細(xì)胞生理狀態(tài)或誘變譜選擇誘變劑，因?yàn)橥徽T變劑的重復(fù)處理會(huì)使細(xì)胞產(chǎn)生抗性，使誘變效果下降。 (二 )處理菌懸液的制備 ? 這一步驟的關(guān)鍵是制備單細(xì)胞和單孢子狀態(tài)的 、活力類似的菌懸液 ， 為此要進(jìn)行合適培養(yǎng)基的培養(yǎng) ， 并要離心 ， 洗滌 ， 過(guò)濾 。 (四 )中間培養(yǎng) 由于在發(fā)生了突變尚未表現(xiàn)出來(lái)之前 ， 有一個(gè)表現(xiàn)延遲的過(guò)程 ， 即細(xì)胞內(nèi)原有酶量的稀釋過(guò)程 (生理延遲 )， 需 3代以上的繁殖才能將突變性狀表現(xiàn)出來(lái) 。 方法： 讓變異處理后細(xì)胞在液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)幾小時(shí) ， 以讓細(xì)胞的遺傳物質(zhì)復(fù)制 ， 讓細(xì)胞繁殖幾代 ， 以得到純的變異細(xì)胞 。 (五 )分離和篩選 ? 篩選分初篩和復(fù)篩 。 ? 復(fù)篩則是精選 ， 以質(zhì)為主 ， 也就是以精確度為主 。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和再?gòu)?fù)篩的菌株 ， 最后才能選得優(yōu)秀菌株 。 紫外線的誘變育種 ? 紫外線誘變一般采用 15W紫外線殺菌燈 ， 波長(zhǎng)為 2537A． 燈與處理物的距離為 15～ 30cm， 照射時(shí)間依菌種而異 ， 一般為幾秒至幾十分鐘 。 ? 被照射的菌懸液細(xì)胞數(shù)，細(xì)菌為 106個(gè)／ ml左右，霉菌孢子和酵母細(xì)胞為 106～ 107個(gè)／ ml。 ? 由于紫外線照射后有光復(fù)活效應(yīng)，所以照射時(shí)和照射后的處理應(yīng)在紅燈下進(jìn)行。 2． 將菌懸液放入一巳滅菌的 ， 裝有玻璃珠的三角瓶?jī)?nèi)用手搖動(dòng) ， 以打散菌體 。 3． 取 2～ 4m1制備的菌液加到直徑 9cm培養(yǎng)皿內(nèi) ，放入一無(wú)菌磁力攪拌子 ， 然后置磁力攪拌器上 、15W紫外線下 30cm處 。 操作均應(yīng)在紅燈下進(jìn)行 ，或用黑紙包住 ， 避免白熾光 。 5．取照射菌液 2ml于液體培養(yǎng)基中 (300ml三角瓶?jī)?nèi)裝 30ml培養(yǎng)液 )， 120r／ min振蕩培養(yǎng) 4～ 6h。 7．挑取菌落進(jìn)行篩選。 硝基 N 亞硝基胍 (NGN ，MNNG或 TG)對(duì)真核或原核微生物都有強(qiáng)烈的誘變作用 。 MNNG的誘變作用隨 pH的升高而增強(qiáng) 。 2． MNNG溶液的制備 用分析天平稱取 2mg， 加入 2ml ／ L pH ， 于暗處振蕩溶解 。 4．死亡率計(jì)算 將未處理的孢子液 1ml加入 1ml磷酸緩沖液中，同上逐級(jí)稀釋分離， 30℃ 下培養(yǎng) 3天。 5．挑取菌落進(jìn)行糖化酶及蛋白酶產(chǎn)量篩選． 第五節(jié) 營(yíng)養(yǎng)缺陷型的選育 ? 營(yíng)養(yǎng)缺陷型是指通過(guò)誘變而產(chǎn)生的缺乏合成某些營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)如氨基酸 、 維生素和堿基等的能力 ，必須在其基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分才能正常生長(zhǎng)的變異株 。 ? 能滿足野生型菌株正常生長(zhǎng)的培養(yǎng)基稱基本培養(yǎng)基 (MM)； ? 在基本培養(yǎng)基中加入相應(yīng)的營(yíng)養(yǎng)成分的稱補(bǔ)充培養(yǎng)基 (SM)； ? 能滿足各種營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)的稱完全培養(yǎng)基(CM)， 如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基 、 麥芽汁培養(yǎng)基等 。目前生產(chǎn)氨基酸 、 核苷酸的菌種都是各種類型的缺陷型 。 篩選營(yíng)養(yǎng)缺陷型的步驟 ? 誘變 ? 淘汰野生型 ? 檢出缺陷型 ? 確定生長(zhǎng)譜 一、誘變方法 ? 物理誘變 ? 化學(xué)誘變 二、淘汰野生型 ? 抗生素法：野生型能在 MM中生長(zhǎng) ， 而缺陷型不能 ， 于是將誘變處理液在 MM中培養(yǎng)短時(shí)讓野生型生長(zhǎng) ， 處于活化階段 ， 而缺陷型無(wú)法生長(zhǎng) ， 仍處于休眠狀態(tài) 。 一般細(xì)菌可以采用青霉素 ， 酵母可采用制霉菌素 。 三、檢出缺陷型 ? 原理：在固體基本培養(yǎng)基和完全培養(yǎng)基上 ， 生長(zhǎng)情況完全不同 ， 缺陷型在 CM上生長(zhǎng)良好 ，而在 MM上則不生長(zhǎng) ， 野生型都能生長(zhǎng) 。 ? 2． 將完全培養(yǎng)基上長(zhǎng)出的全部菌落在絲絨上輕輕一壓 ， 使之成為印模 ， 標(biāo)記方位 。 (一 )影印法 ? 4 ． 將 CM和 MM在恒溫箱中培養(yǎng) 。 MM上未長(zhǎng)而相應(yīng)于 CM上長(zhǎng)出的那幾個(gè)菌落就可能是缺陷型 。 (二 )點(diǎn)種法 ? 也就是任意法 。 ? 此法結(jié)果明確 ， 但工作量大 。 這時(shí)第二批長(zhǎng)出的菌落就可能是缺陷型 。 四、營(yíng)養(yǎng)缺陷型生長(zhǎng)譜的確定 ? 驗(yàn)證確定是缺陷型后 ， 就需確定其缺陷的因子 ， 即生長(zhǎng)譜測(cè)定 。 待凝固后 ， 分別在平皿的 5～ 6個(gè)區(qū)間放上不同的營(yíng)養(yǎng)組合的混合物或吸飽此組合營(yíng)養(yǎng)物的濾紙圓片 。 — 個(gè)平皿測(cè)一個(gè)菌 。 在 5～ 6個(gè)平皿上可測(cè) 20株菌以上 。 一個(gè)完整的基因克隆過(guò)程包括以下步驟 ? １ 、 獲得待克隆的 DNA片段 （ 基因 ） ； ? ２ 、 目的基因與載體在體外連接； ? ３ 、 重組 DNA分子導(dǎo)入宿主細(xì)胞； ? ４ 、 篩選 、 鑒定陽(yáng)性重組子； ? ５ 、 重組子的擴(kuò)增與／或表達(dá) 。 每個(gè)細(xì)胞中存在的質(zhì)粒數(shù)稱為該質(zhì)粒的拷貝數(shù) 。 質(zhì)粒 DNA分子常呈現(xiàn)三種形態(tài)；常見的一種是共價(jià) 、 閉環(huán)狀 DNA(CCC DNA)；其次是由于 —條鏈有缺口而產(chǎn)生的開環(huán) DNA(ocDNA)；第三種是由雙環(huán)分子兩段均斷裂而產(chǎn)生的線性 DNA。 在自然條件下，許多質(zhì)?？山?jīng)細(xì)菌接合或相似方式在宿主間相互轉(zhuǎn)移。 三、質(zhì)粒 DNA的提取方法 ? 細(xì)菌培養(yǎng)和質(zhì)粒擴(kuò)增； ? 細(xì)菌的收獲和裂解； ? 質(zhì)粒 DNA的提取 。 (二 )操作步驟： 質(zhì)粒 DNA轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌 1．從瓊脂平板上挑取新鮮菌落接入 10ml肉湯培養(yǎng)基中， 37℃ 培養(yǎng)過(guò)夜。 3．將 ／ L CaCl2溶液、試管及吸管在冰浴中冷卻。 6．取 10ml培養(yǎng)物置 2個(gè)冷離心管中棄去上清液。 8． 3000r／ min離心 10min，棄去上清液． 9．加入 1ml ／ L CaCl2，重新懸浮細(xì)胞，置冰浴中保存。 11．在冰上放置 20min，在 37℃ 處理 2min。 12．以不同的量涂布選擇培養(yǎng)基平板。鑒定轉(zhuǎn)化菌落。 ? 常用限制性內(nèi)切酶 ? 種類及特性 W. Arber,H. O. Smith 限制性內(nèi)切酶的剪切方式 ? 粘性未端：切開后的兩段 DNA各留下一個(gè)尾 ，這 2個(gè)尾的核苷酸順序完全一樣 ， 中是方向相反 。 其它工具酶 ? 連接酶 T4 DNA ? 修補(bǔ)工具酶 DNA聚合酶 I ? 末端加工酶 S1核酸酶 ， 堿性磷酸單脂酶 ? 末端轉(zhuǎn)移酶 人工加 polyA 或 polyT 尾 ? 反轉(zhuǎn)錄酶 載體－宿主系統(tǒng) ? 載體 (vector)是攜帶外源 DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞進(jìn)行擴(kuò)增和表達(dá)的 DNA； ? 一般是通過(guò)改造質(zhì)粒 、 噬菌體或病毒等構(gòu)建的 。 宿主細(xì)胞必須符合以下條件 ? １、對(duì)載體的復(fù)制和擴(kuò)增沒有嚴(yán)格的限制； ? ２、不存在特異的內(nèi)切酶體系降解外源 DNA； ? ３、在重組 DNA增殖過(guò)程中，不會(huì)對(duì)它進(jìn)行修飾； ? ４、重組缺陷型，不會(huì)產(chǎn)生體內(nèi)重組； ? ５、容易導(dǎo)入重組 DNA分子； ? ６、符合重組 DNA操作的安全標(biāo)準(zhǔn)。 ? cDNA：用 mRNA反轉(zhuǎn)錄成單鏈 DNA，再經(jīng) DNA聚合酶的作用產(chǎn)生雙鏈 DNA。 ? 二、化學(xué)合成法制備 DNA片段 ? 從蛋白質(zhì)肽鏈的氨基酸順序可以知道它的遺傳密碼，再依照密碼合成基因。 PCR技術(shù) ? 根據(jù)需擴(kuò)增片段的兩端設(shè)計(jì)引物。 ? 特點(diǎn)：需要很少的 DNA模板，且能直接從基因組中得到目的基因。DNA連接是由 DNA連接酶催化完成的 。 ? 在分子克隆中最有用的的 DNA連接酶是來(lái)自Ｔ４噬菌體的 DNA 連接酶 。 重組 DNA導(dǎo)入宿主菌 ? 體外連接的重組 DNA分子必須導(dǎo)入適當(dāng)?shù)氖荏w細(xì)胞中才能大量的復(fù)制 、 增殖和表達(dá) 。 一、轉(zhuǎn) 化 ? 指以細(xì)菌質(zhì)粒為載體 ， 將外源基因?qū)胧荏w細(xì)胞的過(guò)程 。 ? 此外還可用電穿孔法轉(zhuǎn)化細(xì)菌 ， 它的優(yōu)點(diǎn)是操