【正文】 加入一定的抗生素即可有效地抑制細(xì)菌生長及菌落形成。 富集可以是種水平的，如通過營養(yǎng)要求的改變來富集分離鐮刀菌；也可以是組成群水平的，如以纖維素為唯一碳源的選擇性培養(yǎng)基可選擇性富集所有能降解纖維素的纖維素裂解微生物。 有時(shí) ， 真菌子實(shí)體形成必須有光線 ， 這在分離培養(yǎng)時(shí)應(yīng)加以考慮 。 這里主要是利用營養(yǎng)成分的減少而使生長減慢 ， 并由此限制真菌的遷涉生長 。 ? 將分離平板上所形成的菌落用經(jīng)火焰灼燒滅菌的鉤形針或無菌牙簽挑取 ， 點(diǎn)接到瓊脂平板上進(jìn)行影印培養(yǎng) ， 以進(jìn)一步篩選和分離 。 ? 通過高倍放大進(jìn)行鏡檢 ， 可了解氣生和營養(yǎng)孢子形成情況 。 ? 水中放線菌的分離： 為使所要分離的放線菌的數(shù)量種類增多，一般將水樣離心或?yàn)V紙過濾，取離心沉積或?yàn)V紙表面沉積進(jìn)行系列稀釋和涂布。 ? 植物體上放線菌的分離：無菌取植物組織，干燥以減少細(xì)菌數(shù)量，剪碎植物材料后植入平板表層后培養(yǎng)。 ? 分離瓊脂平板制備好后 ， 一般皆應(yīng)在 37℃ 培養(yǎng)箱中存放 3天 。 ? 在放線菌分離瓊脂中通常都加入抗真菌劑制霉菌素或放線菌酮 ， 以抑制真菌的繁殖 。 （三）培養(yǎng)基的組成原則 ? 大多數(shù)放線菌的分離培養(yǎng)是在貧脊或復(fù)雜底物的瓊脂平板上進(jìn)行的 。 ? 樣本采集完后 ， 應(yīng)及時(shí)處理或在 4℃ 下貯存 ，貯存試樣處應(yīng)與劃線 ， 篩選平板分開 ， 貯存時(shí)間不宜過長 。 五、放線菌的分離 ? (一 )采樣及采集方法 ? 應(yīng)盡可能實(shí)行無菌操作。 篩選平板經(jīng)培養(yǎng)后 ， 按生長出菌落的形態(tài)學(xué)特征如色素 、 菌落形態(tài)等進(jìn)行最初分組 。 次代培養(yǎng)及純化步驟 涂布的平板經(jīng)培養(yǎng)后 ， 如生長出菌落 ， 則按涂布不同稀釋度的稀釋液所得的單菌菌落和多菌菌落對瓊脂平板進(jìn)行分類 。 ? 另一富集方法是在培養(yǎng)燒瓶中添加細(xì)菌 “ 附著材料 ” ， 如無菌的植物組織或土壤浸出液 。 水中細(xì)菌分離的簡易富集技術(shù) ? 在無菌的 、 用棉團(tuán)塞好的廣口三角燒瓶中連續(xù)培養(yǎng) ， 定期取樣涂布適宜分離瓊脂平板上； ? 在不同水體的水樣中加入一定的底物如蔗糖 、 多糖及蛋白質(zhì)等 ， 同樣可以促進(jìn)水中微生物的增殖 。 ? 水中細(xì)菌的分離：水樣通過 ，取出濾膜用 1ml無菌稀釋液將濾膜上的沉積洗下。 ? 土樣中細(xì)菌的富集：適度稀釋后，取 添加及未添加富集底物 (如幾丁質(zhì)、纖維素等 )的土浸出汁平板。 富集方法 ? 運(yùn)用細(xì)菌的酶誘導(dǎo)性，在分離培養(yǎng)基中添加若干抗生素、復(fù)雜底物及生長因子的前體物質(zhì)來激活細(xì)菌某一特殊基因組，可以建立起若干富集技術(shù)。 土中細(xì)菌的富集培養(yǎng)與分離 ? 分離土樣中的大部分細(xì)菌的分離程序中無需進(jìn)行富集。 瓊脂平板在使用前應(yīng)置于 37℃ 培養(yǎng)箱中孵育 l、2天。 加入培養(yǎng)基中的天然提取物 ， 部分培養(yǎng)基中則應(yīng)含有多種碳 、 氮源 ，如幾丁質(zhì) 、 纖維素或果膠 。 (二 )生態(tài)學(xué)參數(shù)及培養(yǎng)基 的組成原則 加入培養(yǎng)基中的天然提取物種類和用量 、 環(huán)境生物物理學(xué)參數(shù)以及用于平板涂布分離樣本的溶劑都會影響實(shí)驗(yàn)中所要分離的細(xì)菌的數(shù)量和種類 。 水樣不應(yīng)裝滿采樣瓶 。 如果有急流存在的話 ， 應(yīng)直接將瓶口反向于急流 。 ? 由于表層水中含有泥沙 ， 故在采樣時(shí)應(yīng)在較深的靜水層中采集水樣 。 將洗凈的根裝入采樣袋中 ， 采集根系時(shí) ，一般與根際土樣一起保存 。 ? 選擇葉面時(shí)應(yīng)考慮葉位 、 葉齡 、 葉片正反面和在一片葉上的取樣部位 。 ? 在采集植物根際土樣時(shí) ， 一般方法是自土壤中慢慢拔出植物根 ， 在大量無菌水中浸漬約 20min， 洗去粘附在根上的土壤 ， 然后再用無菌水漂洗下根部殘留的土 ， 這部分上卻為根際土樣 。 如果層次要求不嚴(yán)格 ， 可取離地面 5～15cm處的土 。 采樣的注意事項(xiàng) 采樣時(shí)應(yīng)盡可能保持相對無菌； 所采集的樣本必須具有某種代表性； 采好的樣必須完整地標(biāo)上樣本的種類及采集日期 、 地點(diǎn)以及采集地點(diǎn)的地理 、 生態(tài)參數(shù)等； 應(yīng)充分考慮采樣的季節(jié)性和時(shí)間因素 ， 因?yàn)檎嬲脑鼐旱某霈F(xiàn)可能是短暫的； ? 采好的樣應(yīng)及時(shí)處理，暫不能處理的也應(yīng)貯存于 4℃ 下，但貯存時(shí)間不宜過長。 四、自然界中細(xì)菌的分離 (一 )采樣和采集方法 ? 為了從一特定生態(tài)系統(tǒng)中分離出具有代表性的細(xì)菌菌群 ， 特別是分離那些在唯一微環(huán)境區(qū)域中出現(xiàn)的菌群時(shí) ， 必須十分重視樣本的采集 。 選擇適宜的培養(yǎng)分離方法和檢測方法 。 一、成功的分離培養(yǎng)方法 (1)認(rèn)真考它所需產(chǎn)品的特征和生產(chǎn)過程； (2)制訂初步的篩選標(biāo)準(zhǔn)； (3)將生態(tài)學(xué)方法運(yùn)用到分離和篩選過程 。 ? 在任一試樣中所存在的微生物僅為極少數(shù)特定種類的菌株；在工業(yè)微生物篩選過程中 ， 應(yīng)及時(shí)調(diào)整檢測方法 ， 以與各種不同類型的生長和代謝之微生物相適應(yīng) 。 第二節(jié) 培養(yǎng)分離 ? 從自然界中分離培養(yǎng)微生物是菌種選育的重要和基礎(chǔ)的步驟 。 （五）毒性試驗(yàn) ? 自然界的一些微生物是在一定條件下產(chǎn)毒的 ，將其作為生產(chǎn)菌種應(yīng)當(dāng)十分當(dāng)心 ， 尤其與食品工業(yè)有關(guān)的菌種 ， 更應(yīng)慎重 。 純種分離的方法有劃線分離法 、 稀釋分離法 。 因此還必須分離 ， 純化 。 這樣對下階段的純種分離就會順利得多 。 （二）增殖培養(yǎng) ? 為了容易分離到所需的菌種 ， 讓無關(guān)的微生物至少是在數(shù)量上不要增加 ， 可以通過配制選擇性培養(yǎng)基 ， 選擇一定的培養(yǎng)條件來控制 。 ? 采土方式：在選好適當(dāng)?shù)攸c(diǎn)后 ， 用小薩子除去表土 ， 取離地面 515cm處的土約 10g， 盛入清潔的牛皮紙袋或塑料袋中 ， 扎好 ， 標(biāo)記 ， 記錄采樣時(shí)間 、 地點(diǎn) 、 環(huán)境條件等 ， 以備查考 。 采樣的對象也可以是植物 ， 腐敗物品 ， 某些水域等 。 三、新種分離與篩選的步驟 （ 一）采樣 采樣對象 以采集土壤為主 。 ? 發(fā)酵性能測定： 進(jìn)行生產(chǎn)性能測定 。 ? 增殖： 人為地通過控制養(yǎng)分或培條件 ， 使所需菌種增殖培養(yǎng)后 ， 在數(shù)量上占優(yōu)勢 。 ? 定方案： 首先要查閱資料 ， 了解所需菌種的生長培養(yǎng)特性 。 ? 實(shí)驗(yàn)室或生產(chǎn)用菌種若不慎污染了雜菌 ， 也必須重新進(jìn)行分離純化 。第四章 生產(chǎn)中常用菌種的分離、選育和保藏 主講人：韓北忠 劉 萍 帶圖象分析系統(tǒng)的微生物菌種 顯微觀察裝置 第一節(jié) 菌種的分離簡介 一、菌種的來源 ? 根據(jù)資料直接向有科研單位 、 高等院校 、 工廠或菌種保藏部門索取或購買； ? 從大自然中分離篩選新的微生物菌種 。 二、分離思路 ? 新菌種的分離是要從混雜的各類微生物中依照生產(chǎn)的要求 、 菌種的特性 ， 采用各種篩選方法 ，快速 、 準(zhǔn)確地把所需要的菌種挑選出來 。 ? 有了優(yōu)良的菌種，還要有合適的工藝條件和合理先進(jìn)的設(shè)備與之配合。 ? 采樣： 有針對性地采集樣品 。 ? 分離： 利用分離技術(shù)得到純種 。 這些特性包括形態(tài) 、 培養(yǎng)特征 、 營養(yǎng)要求 、 生理生化特性 、 發(fā)酵周期 、 產(chǎn)品品種和產(chǎn)量 、 耐受最高溫度 、 生長和發(fā)酵最適溫度 、 最適 pH值 、 提取工藝等 。 一般園田土和耕作過的沼澤土中 ， 以細(xì)菌和放線菌為主 ，富含碳水化合物的土壤和沼澤地中 ， 酵母和霉菌較多 ， 如一些野果生長區(qū)和果園內(nèi) 。 從自然界篩選 ? 采樣季節(jié)：以溫度適中 ， 雨量不多的秋初為好 。 為了使土樣中微生物的數(shù)量和類型盡少變化 ， 宜將樣品逐步分批寄回 ， 以便及時(shí)分離 。 ? 例如碳源利用的控制 ， 可選定糖 ， 淀粉 、 纖維素 ， 或者石油等 ， 以其中的一種為唯一碳源 ， 那么只有利用這一碳源的微生物才能大量正常生長 ，而其它微生物就可能死亡或淘汰 。 （三）培養(yǎng)分離 ? 盡管通過增殖培養(yǎng)效果顯著 ， 但還是處于微生物的混雜生長狀態(tài) 。在這 — 步 ， 增殖培養(yǎng)的選擇性控制條件還應(yīng)進(jìn)一步應(yīng)用 ， 而且控制得細(xì)一點(diǎn) ， 好一點(diǎn) 。 （四）篩 選 ? 這一步是采用與生產(chǎn)相近的培養(yǎng)基和培養(yǎng)條件 ， 通過三角瓶的容量進(jìn)行小型發(fā)酵試驗(yàn) ， 以求得適合于工業(yè)生產(chǎn)用菌種 。 據(jù)有的國家規(guī)定 ，微生物中除啤酒酵母 、 脆壁酵母 、 黑曲霉 、 米曲霉和枯草桿菌作為食用無須作毒性試驗(yàn)外 ，其他微生物作為食用 ， 均需通過兩年以上的毒性試驗(yàn) 。 ? 到目前為止 ， 還沒有一種分離培養(yǎng)方法能揭示一個試樣中所包含的所有微生物總數(shù)和種類 。 ? 因此 ， 建立一更為科學(xué)的和針對性不強(qiáng)的分離方法是必要的 。 二、培養(yǎng)分離中要解決的問題 “ 分離什么和從哪里分離出 ?” 必須充分考慮所分離微生物的生產(chǎn)能力 、 生長速度 、 生物群體培養(yǎng)和產(chǎn)品生產(chǎn)工藝及其提純的難易和費(fèi)用 ， 工業(yè)生產(chǎn)發(fā)酵罐中穩(wěn)定性及遺傳操作的難易程度等 。 三、將生態(tài)學(xué)方法用于培養(yǎng)分離的一般思路要點(diǎn) ? 1． 羅列出所要分離的微生物類群； ? 2． 根據(jù)所采集樣本的各種生態(tài)參數(shù) ， 描述所要分離的微生物之生態(tài)系統(tǒng)或棲息地： ? 3． 將若干樣本分成若干類型 ， 如植物和植物各部 ， 土壤 (類型和土層 )、 巖石 、 水 、 昆蟲和發(fā)酵食品等； ? 4． 羅列出所要考察和測量的環(huán)境參數(shù) ， 如 pH、鹽分 、 水分 、 氧化還原電勢及溫度等； 5．列出生物系統(tǒng)中有用的自然底物，如森林土壤中的幾丁質(zhì)、葡萄表皮的果膠； 6．根據(jù)上述 15項(xiàng)中所獲得的數(shù)據(jù)，設(shè)計(jì)分離方法，即選擇適宜的稀釋液、底物、試樣、天然浸出汁和培養(yǎng)條件； 7．用標(biāo)準(zhǔn)方法作對照來評價(jià)生態(tài)學(xué)分離方法； 8．根據(jù)待檢材料的生態(tài)參數(shù)需要，修改已知的方法； 9．運(yùn)用特定的富集方法，富集那些可能具有篩選意義的微生物類群。 ? 樣本采集時(shí)所需的工具通常有無菌刮鏟 、 土樣采集器 、 鑷子 、 解剖刀 、 手套 、 無菌小塑料袋和塑料瓶等 。這是因?yàn)橐坏┎蓸咏Y(jié)束，試樣中的微生物群體就脫離了原來的生態(tài)環(huán)境，其內(nèi)部生態(tài)環(huán)境就會發(fā)生變化，微生物群體之間就會出現(xiàn)消長 1．土樣采集方法 ? 森林 、 旱地 ， 草地可先掘洞 ， 由土壤下層向上層順序采集； ? 水田等浸水土壤在不損土層結(jié)構(gòu)的情況下插入圓筒采集 。 將采集到的土樣盛入聚乙烯袋或玻璃瓶中 。 2．植物體采集方法 ? 在采集葉面時(shí) ， 一般是用滅菌的剪刀 、 打孔器 、安全刀片等 ， 由幾片新鮮葉片的同一部位切取一小塊 ， 并注意不要損傷周圍邊緣 。 ? 采集植物根及根系時(shí) ， 方法與根際土樣采集方法相似 。 3．水樣采集方法 ? 用于細(xì)菌檢測的水樣應(yīng)收集于 100m1干凈 、 滅菌的廣口塑料瓶中 。 ? 方法是：握住采樣瓶底浸入水中 3050cm處 ， 然后瓶口朝下打開瓶蓋 ， 讓水樣進(jìn)入 。 采集瓶從水中取出時(shí)應(yīng)迅速并帶有較大的弧度 。 所有水樣都應(yīng)在 24h之內(nèi)迅速進(jìn)行檢測 ，或者 4℃ 下貯存 。 就分離培養(yǎng)基的組成而言 ， 部分培養(yǎng)基中必須含有 1050%的天然提取物 。 所有分離培養(yǎng)基中都應(yīng)含有抗真菌劑 (如放線菌酮和制霉素 )，摻加濃度一般為 50μg／ m1， 以抑制真菌的生長。 培養(yǎng)基的生物物理學(xué)參數(shù)，如 pH及鹽分也應(yīng)調(diào)節(jié)到與試樣的生態(tài)系統(tǒng)參數(shù)值相近。 ? 但對某些少數(shù)細(xì)菌則要求特殊的富集或選擇技術(shù)才能很好地被分離培養(yǎng) 。 ? 富集可以促進(jìn)抗性的產(chǎn)生并維持下來。 ? 植物體上細(xì)菌的分離：無菌富集，加植物浸出液適度培養(yǎng)取樣，洗滌，取 1ml經(jīng)適度稀釋后涂布平板。用樣本稀釋液適度稀釋 ,涂布平板倒置培養(yǎng)或?yàn)V紙壓印分離法。 ? 培養(yǎng)過程中可加入低濃度的抗真菌劑以抑制真菌的生長 。 ? 通過改變培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)周期可選擇性富集嗜冷性細(xì)菌 、 中溫菌和嗜高溫菌 。 用無菌牙簽將菌落轉(zhuǎn)接到篩選平板上及轉(zhuǎn)接至添加有少量