【正文】 動物實(shí)驗(yàn)、藥理、毒理、細(xì)胞培養(yǎng)材料約 3 萬。 第三階段：（ 200 ）資料匯總、總結(jié)、處理數(shù)據(jù)、分析與研究成果撰寫論文、上報(bào)鑒定、鑒定后申報(bào)成果。 第一階段：（ ~）調(diào)研及資料檢索，準(zhǔn)備階段并上報(bào)待批。 已有以下主要儀器設(shè)備，可滿足本項(xiàng)研究使用。 近年來發(fā)表論文33 篇，其中國家級刊物 30 篇 [第一作者 30 篇 ]，省級刊物 3 篇 [第一作者 3 篇 ] 。通過成果鑒定項(xiàng)目有：《病毒清眼膜的研制》《消癥 19 飲治療子宮內(nèi)膜異位癥臨床和實(shí)驗(yàn)研究》《強(qiáng)心合劑治療心衰的臨床及實(shí)驗(yàn)研究》《病竇靈治療竇房結(jié)綜合癥臨床及實(shí)驗(yàn)研究》《烏鱉口服液治療卵巢功能早衰的實(shí)驗(yàn)研究》《 益腎健脾顆粒劑治療青春期功血的臨床和實(shí)驗(yàn)研究》《四通顆粒劑與紫外線照射充氧自血回輸結(jié)合治療急性缺血性中風(fēng)的臨床及機(jī)理研究》 《熱痹消治療急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎的研究》 《從脾肺論治免疫性潰瘍性結(jié)腸炎（ IUC）的臨床和實(shí)驗(yàn)研究》《大黃蟄蟲丸對阿霉素腎病伴高血脂癥大鼠的實(shí)驗(yàn) 研究》 《滋陰抑元顆粒對免疫性不孕的機(jī)理研究》 《腦血通對急性出血性腦中風(fēng)的實(shí)驗(yàn)研究》 《茱萸顆粒對病毒性心肌炎免疫損傷作用的研究》。主要從事中藥藥理，毒理和中藥制劑的研究工作。本組方的提供者是本院的風(fēng)濕科，該科擁有?？撇》浚?20 張病床）及全天?？崎T診，同時還開展了專病門診（包括OA），技術(shù)力量較強(qiáng)，技術(shù)水平較高，在省內(nèi)外中西醫(yī)風(fēng)濕界均有一定的影響。本所具有江蘇省科學(xué)技術(shù)委員會，江蘇省標(biāo)準(zhǔn)局頒布的動物飼育環(huán)境合格證書，動物質(zhì)量合格證書，人員素質(zhì)高，均擁有實(shí)驗(yàn)動物從業(yè)人員崗位證書。 對軟骨細(xì)胞的細(xì)胞凋亡、增殖、 NO 含量及 iNOS 基因表達(dá)的影響 將各組方藥液分別配置成最大無毒濃度，加入已長成單層軟骨細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)板內(nèi)，具體檢測操作則同加入含藥血清的實(shí)驗(yàn)。 對軟骨細(xì)胞蛋白合成和 NO 含量的影響 同樣將各組 含藥血清加入已長 18 成單層細(xì)胞的培養(yǎng)板內(nèi)， CO2 恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng) 48h 后，收集上清液，用全自動生化分析儀檢測總蛋白含量，用分型 NOS 試劑盒和 NO 試劑盒檢測各組 iNOS、 NO 含量。取上清，每孔加入 200ul 溶甲瓚液，以主波長 570nm，參比波長 690nm 于酶標(biāo)儀上比色，讀取吸光度（ A）值。二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱孵育 72h 后，取上清液。先用 %胰酶消化 30min，然后去除胰酶，加入 %膠原酶Ⅱ消化 7~8 小時后， 1500rpm10min 離心，棄上清，加入 PBS，搖勻在同上離心棄上清，在加 PBS 反復(fù)三次，最后一次加含 15%胎牛血清 DMEM 培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打均勻， 200 目篩網(wǎng)過濾，放入培養(yǎng)瓶中， 5%CO237℃培養(yǎng)箱 培養(yǎng)，定期換液，并觀察照相，長滿后用 %胰酶消化傳代。漂洗完畢后，用無菌的眼科小剪刀在培養(yǎng)皿中將其細(xì)切至不大于 1mm3。 觀察指標(biāo)： ① 大體肉眼觀察軟骨及滑膜表面情況； ② HE 染色觀察有關(guān)的形態(tài)變化； ③ Masson 三色染色觀察膠原的變化； ④ SanfraninO 即 沙紅 O 染色用于組織學(xué)評分，評分方法按 Mankin 法（附評分等級表 如下）； ⑤ 電鏡下觀察軟骨細(xì)胞內(nèi)結(jié)構(gòu)形態(tài)變化及其周圍膠原纖維的變化。再用銳利刀片切取股骨內(nèi)倮軟骨使其呈 2mm 1mm 全層軟骨標(biāo)本， %戊二醛溶液固定，電鏡下觀察。 方法：將造模后的大鼠隨機(jī)分為模型組、陽性對照組（維骨力組）、治療組，另設(shè)正常對照組，分別灌胃給藥或蒸餾水，連續(xù) 7 周。術(shù)后第二天放造模大鼠于拖箱內(nèi)每天趕其行走 30m。 。 現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)與中醫(yī)藥理論相結(jié)合，深入研究中醫(yī)藥治療 OA 的作用機(jī)制，為臨床應(yīng)用提供更加科學(xué)有利的客觀依據(jù)，發(fā)揮中醫(yī)藥治療 OA 的特色和優(yōu)勢，為臨床常見、嚴(yán)重影響人類健康的 OA 研究出有效、安全、便于推廣應(yīng)用的中醫(yī)藥治療方法，使能迅速緩解癥狀，大大減輕病人痛苦，降低膝骨關(guān)節(jié)炎的致殘率和復(fù)發(fā)率，且副作用小的簡、便、廉、驗(yàn) 的中藥制劑問世。在細(xì)胞培養(yǎng)的相關(guān)檢測中，我們采用 MTT 法檢測軟骨細(xì)胞的增殖能力，用全 自動生化分析儀對檢測總蛋白含量，使用細(xì)胞流式儀進(jìn)行細(xì)胞凋亡的測定，對 iNOS、 NO 含量的測定則使用分型NOS 試劑盒和 NO 試劑盒。培養(yǎng)過程中一般使用 5%CO237℃ 的恒溫培養(yǎng)箱。目前還沒有專門用于軟骨細(xì)胞培養(yǎng)的培養(yǎng)液，國外采用的培養(yǎng)液種類繁多，有 19 16 F1改良 Eagle 等，國內(nèi)的有 19 16 DMEM（高糖）等，其中加入胎牛血清（占 15%），一般以使用 DMEM 培養(yǎng)液居多。 關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞的獲取和培養(yǎng) 基于來源廣 泛，操作可行的原則，目前用于體外培養(yǎng)的軟骨細(xì)胞一般均為兔關(guān)節(jié)軟骨細(xì)胞原代培養(yǎng)所得。在具體的造模過程中我們選用以上兩種方法來分別復(fù)制動物模型。在誘發(fā)模型中，常用的方法是手術(shù)造成關(guān)節(jié)的應(yīng)力改變及關(guān)節(jié)腔內(nèi)注入木瓜蛋白酶， 這兩種方法都能復(fù)制出較成功較高的 OA 模型，且操作較為簡單。 主要技術(shù)關(guān)鍵 膝 OA 模型的復(fù)制 目前所使用的 OA 動物模型一般可分為兩大類，其一是誘發(fā)模型，即通過各種操作方法如制動、手術(shù)、關(guān)節(jié)內(nèi)注藥、關(guān)節(jié)內(nèi)植入軟骨碎片或微粒等誘導(dǎo) OA 產(chǎn)生；另一類為自發(fā)模型，即不用任何外界干預(yù)，動物自發(fā) OA，如 C57 黑鼠等。 主要內(nèi)容 探討 OA 的病因病機(jī)，提出新見解，發(fā)展中醫(yī)理論。隨著改革開放的形勢發(fā)展，以及中國加入WTO 與國際接軌的進(jìn)程的不斷完善，祖國醫(yī)學(xué)國際地位不斷的提高，我們將從祖國醫(yī)學(xué)寶庫中發(fā)掘出的治療 OA 的高效藥物與現(xiàn)代新技術(shù)、新方法進(jìn)行研究總結(jié)，從而為人類造福，為振興中醫(yī)事業(yè)做出應(yīng)有的貢獻(xiàn)。 目前，中藥治療 OA 的方法頗多，但大多以臨 床療效研究為主，大樣本、規(guī)范化的研究很少，中醫(yī)中藥治療機(jī)理的研究，雖有涉及，但大多分散且存在一定的重復(fù)性，理想的治療藥物尚未問世，具有公認(rèn)療效的小兒遷延性腹瀉臨床治療方案尚未確立，其療效評價體系尚需研究確定，尤其是缺少中醫(yī)藥治療學(xué)整體研究思路與方法，使中藥復(fù)方治療 OA 的療效機(jī)理尚未能全面揭示，影響了該領(lǐng)域研究的深入。 本研究達(dá)到的科學(xué)技術(shù)水平，預(yù)期社會效益和應(yīng)用推廣前景 繼承和發(fā)揚(yáng)祖國醫(yī)學(xué)，保持中醫(yī)特色，以臨床療效為前提，以實(shí)驗(yàn)研究為基礎(chǔ)，制造規(guī)范化大鼠的膝 OA 模型，從發(fā)病機(jī)理探 討本藥的作用機(jī)制。通過 36例的臨床研究、觀察，結(jié)果表明本方療效顯著且副作用小。基于現(xiàn)代醫(yī)學(xué)對OA 發(fā)病機(jī)理的深入研究，我們 在補(bǔ)益肝腎、活血通絡(luò)基礎(chǔ)上，結(jié)合中藥對緩解軟骨降解，增加軟骨細(xì)胞功能，抑制滑膜增生及炎癥的研究成果，于 1995 年即對《備急千金要方》中的獨(dú)活寄生湯進(jìn)行化裁，重用活血化淤，加用化痰清熱之品，總結(jié)制定出了高效、藥源廣泛、安全可行的痛痹顆粒，并于 1999 年采用痛痹顆粒的組方治療膝 OA，方中以獨(dú)活為君藥，以祛下焦與筋骨間風(fēng)寒濕邪；威靈仙舒筋通絡(luò)止痹痛；淫羊藿、懷牛膝補(bǔ)肝腎，強(qiáng)筋骨，通經(jīng)絡(luò)，其中懷牛膝為引經(jīng)藥；當(dāng)歸養(yǎng)血柔肝、舒筋活血；川芎則通達(dá)四肢關(guān)節(jié)，為血中氣藥；虎杖活血清熱解毒，同時防諸藥辛燥太過。 選題的理論和實(shí)踐依據(jù) 祖國醫(yī)學(xué)并無骨關(guān)節(jié)炎的病名，從歷代文獻(xiàn)來看本病應(yīng)歸屬于“骨痹”、“痛痹”范疇。在 NO 對 OA 影響的實(shí)驗(yàn)中，一般采用硝酸還原酶法來測定 NO 含量，運(yùn)用 PTPCR 技術(shù)測定 NOS 基因表達(dá)。動物實(shí)驗(yàn)不再只局限于微循環(huán)和一般抗炎、鎮(zhèn)痛試驗(yàn)，現(xiàn)已使用針 對 OA 的動物實(shí)驗(yàn)，并采用相關(guān)的指標(biāo)進(jìn)行檢測。陸智報(bào)道用本方加減治療 104例，總有效率 %。朱健兒以本方加味治療 262 例，總有效率 %。治療方面從古到今絕大部分醫(yī)家皆針對其病因病機(jī)采用益肝腎、強(qiáng)筋骨、補(bǔ)氣血治 其本；散寒通絡(luò)、化痰勝濕治其標(biāo)。中醫(yī)認(rèn)為 OA 屬痹癥中的痹、痛痹、骨痹，認(rèn)為其病因與年老體衰、長期勞損、外感風(fēng)寒濕邪有關(guān)，明確指出肝腎虧虛、氣血不足、筋骨失養(yǎng)為 OA 的發(fā)病基礎(chǔ)，而寒濕、痰瘀為病理因素及病理產(chǎn)物。③未針對 OA 發(fā)病機(jī)制進(jìn)行臨床及動物試驗(yàn)從生化 、免疫、病理、細(xì)胞分子水平來探討中藥的藥物作用機(jī)理。中哦藥治療 OA 的研究取得了可喜的進(jìn)步，但中藥治療仍存在較多共性的問題：①多屬臨床經(jīng)驗(yàn)，無對照組，特別 12 是西藥對照組觀察，處方不固定。 治療方面有了不少新方法 目前中西醫(yī)治療 OA 的藥物較多，西藥治療 OA 主要有三大類，第一類為快作用藥，即非甾體藥，特點(diǎn)是發(fā)揮作用快，但副作用較大，對胃腸、肝腎、血小板均有較大影響， OA 多為老年人，長期服用此類藥尤其不能耐受，且部分藥物價格不菲，而且由于過分的鎮(zhèn)痛，導(dǎo)致病人失去警惕過分運(yùn)動，以致出現(xiàn)“消炎痛髖”，從長期療效來看反而不佳，最新觀點(diǎn) 認(rèn)為乙酰氨基酚應(yīng)作為治療 OA 的首選藥，但尚有一定爭議，且同樣存在上述副作用；第二類為慢作用藥，發(fā)揮作用慢，療效不確切，價格昂貴，臨床上尚未廣泛運(yùn)用；第三類為軟骨保護(hù)劑，尚未問世。 Fas 表達(dá)的結(jié)果與其相符 ,OA 受損區(qū)的 Fas 表達(dá)遠(yuǎn)高于未受損區(qū) ,提示 Fas 表達(dá)可誘 導(dǎo)軟骨細(xì)胞凋亡。二是 NO 與超氧化陰離子Ｏ 2反應(yīng) ,生成氧化亞硝基陰離子 ONOO,在酸性條件下 (如病理?xiàng)l件 )迅速分解為 OH和 NO2 自由基 ,這兩種自由基具有很強(qiáng)的細(xì)胞毒性 ,可造成組織細(xì)胞損傷。NO 通過兩種方式造成組織及細(xì)胞損傷。典型的 OA 不存在明顯的炎癥反應(yīng) ,此時軟骨細(xì)胞凋亡以 NO 途徑為主 。 OA 軟骨細(xì)胞凋亡主要通過兩種相互獨(dú)立的途徑完成，一種是同滑膜炎癥無關(guān)的途徑 ,由 NO 介導(dǎo) 。細(xì)胞凋亡學(xué)說：細(xì)胞凋亡是細(xì)胞死亡的形式之一，許多正常組織均可發(fā)現(xiàn)凋亡，但凋亡亢進(jìn)與不足則會引起相關(guān)疾病，在骨關(guān)節(jié)炎患者軟骨中軟骨細(xì)胞 的凋亡有異常表現(xiàn)，且凋亡細(xì)胞數(shù)目與骨關(guān)節(jié)炎嚴(yán)重程度明顯相關(guān)。 NOS 可催化重要炎 11 性介質(zhì) NO 的產(chǎn)生， OA 患者血清、滑液中 NO 含量明顯高于正常?；|(zhì)金屬蛋白酶，尤其是基質(zhì)溶素和膠原酶，參與關(guān)節(jié)軟骨的降解過程，這些酶類可以降解細(xì)胞外基質(zhì)的所有成分，與循環(huán)系統(tǒng)中的纖維蛋白溶酶和局部合成的纖溶酶原一起，快速降解軟骨。參與降解基質(zhì)大分子的降解酶類可以增加達(dá)到幾倍。骨關(guān)節(jié)炎時，滑膜、滑液、血管翳內(nèi)常有中性白細(xì)胞、巨嗜細(xì)胞浸潤，其表面受免疫復(fù)合物、補(bǔ)體等作用能釋放大量 O2和 H2O2；細(xì)胞因子學(xué)說：細(xì)胞因子對骨關(guān)節(jié)炎的發(fā)生、發(fā)展起了重要作用，如白細(xì)胞介素 1（ IL1）、白細(xì)胞介素 6(IL6)、腫瘤壞死因子（ TNF）等在 OA 中水平明顯增高。自由基學(xué)說：認(rèn)為自由基對軟骨細(xì)胞 DNA 和 PG的合成具有抑制作用。 病因、發(fā)病機(jī)制有了巨大突破 目前基礎(chǔ)研究認(rèn)為軟骨的損傷與退變是 OA 的根本，隨著分子生物學(xué)免疫學(xué)的發(fā)展，近年來眾多學(xué)者對 OA 關(guān)節(jié)軟骨退行性改變的原因從不同角度進(jìn)行了大量研究，其發(fā)病機(jī)制仍未 完全明了，又提出了許多學(xué)說，如軟骨下骨內(nèi)高壓學(xué)說：由于骨血液動力學(xué)的改變，在骨髓腔容積不變的前提下增加內(nèi)容物引起壓力增高，即表現(xiàn)為骨內(nèi)壓力增高。根據(jù) 1994 年統(tǒng)計(jì)，在美國，骨關(guān)節(jié)炎的消耗為 155 億美元，約為類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎的 3 倍，其中一半以上消耗緣于工作喪失。在 Framingham 的研 10 究中， Felaon 等發(fā)現(xiàn)女性體重減少 11 磅，骨關(guān)節(jié)炎形成的風(fēng)險(xiǎn)相應(yīng)減少 50%。國內(nèi)陳順樂等調(diào)查結(jié)果 OA 是頸椎最多，以下依次為腰椎、膝、手和腕。另外不同關(guān)節(jié) OA 易感性不同。國內(nèi)陳順樂等隊(duì) 13541 名鋼鐵工人的調(diào)查結(jié)果顯示，癥狀性 OA 患病率 %；無癥狀性O(shè)A 患病率 53%，其中 30— 3 40— 4 50— 59 歲患病率各 為 11%、 27%和 62%。 Felson 等報(bào)道 70 歲以下人群膝 OA 患病率為 7%（男%，女 %）， 80 歲以上為 %（男 %，女 %）；而放射學(xué)膝 OA70 歲以上為 %（男 %，女 %）， 80 歲以上為 %。雖然中藥治療 OA 也取得了一些經(jīng)驗(yàn)，但對其具體的作用機(jī)制有深入研究的卻很少，因此在中醫(yī)理論的指導(dǎo)下，運(yùn)用現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)，對療效確切的中藥復(fù)方進(jìn)行深入的機(jī)理研究，使中藥治療 OA 的療效在國際先進(jìn)行列中占一席之地，是擺在我們面前非常重要的課題。近年來對 OA 的研究頗多，在發(fā)病機(jī)制、檢測手段以及治療方法上均取得較大進(jìn)步，但總的來說還缺乏令人滿意的突破性進(jìn)展。隨著計(jì)劃生育政策的長久實(shí)施及經(jīng)濟(jì)發(fā)展，我國已進(jìn)入老齡化社會， OA的發(fā)病率還將越來越高，這不僅嚴(yán)重危害人民的生活、健康，對社會也將造成很大負(fù)擔(dān)。該病發(fā)病率隨年齡增長而升高，據(jù)調(diào)查，在美國目前 2 億多人口中，就有骨關(guān)節(jié)炎 4500 萬，發(fā)病率占總?cè)丝诘?20%，在老年人中所占比例更高，50 歲以上人群中， OA 的患病率僅次于心血管疾病，位居第二位。 三、封面上“登記序號”“項(xiàng)目編號”請勿填寫。 填寫說明 一、內(nèi)容填寫自備附頁，用紙大小和封頁一致，字跡清楚，裝訂