組化3第三章酶組化(參考版)
2025-01-09 07:20本頁(yè)面
【正文】 。 (5)對(duì)照：用四異丙基焦磷酰胺（ ISO－OMPA） 4mM(%)堿酯酶酶而顯示乙酰膽堿酯酶 (AchE)。 （ 3）染色步驟： ①新鮮組織，冰凍切片； ②固定：冷丙酮或 10％福爾馬林固定 20~25分鐘； ③蒸餾水洗； ④入孵育液 ,室溫或 37℃ ，恒溫孵育 1~2小時(shí)； ⑤蒸餾水洗； ⑥甘油明膠封固。 （ 2）孵育液的配制： 乙酰硫膽堿碘鹽 (acetyl thiocholine iodide) 5mg (acetate buffer) （ %）檸檬酸鈉 30mM()CuSO4 蒸餾水 1ml 5mM(%)鐵氰化鉀 (potassium ferricyanide) 1ml 乙酰硫膽堿碘鹽完全溶解于醋酸緩沖液后， 依次入其他溶液，臨用前不超過(guò) 30分鐘內(nèi)配制 ，充分混勻至溶液呈亮綠色。證明酶活性的存在。 用酯來(lái)檢測(cè)底物特異性時(shí) ， AchE能最快地促進(jìn)乙酰膽堿分解 ， 也能分解乙酰基－ β－甲基膽堿 ， 但不能分解苯甲酰 （ 基 ） 膽堿 ， 同時(shí)， 此酶能被 高濃度的乙酰膽堿所抑制 ， 但是 ChE則不同 ， 乙酰膽堿濃度越高 ， 越能被 ChE所分解。 八、乙酰膽堿酯酶和膽堿酯酶 (一 ) 名稱 常用名 :乙酰膽堿酯酶 (Acetylcholinesterase), 膽堿酯酶 (cholinesleraes) (二 )反應(yīng)原理 廣義的膽堿酯酶可分為乙酰膽堿酯酶 (AChE)和狹義的膽堿酯酶 (ChE)兩大類 。 (4)結(jié)果與評(píng)價(jià)： 磷酸黑色硫化鉛沉淀為酯酶活性所在部位。 ④ 1％ Pb(NO3)2浸 15分鐘 。 （三）、光鏡顯示方法 硫化鉛法 （ 1）原理：以吐溫為底物，在脂酶的作用下，分離出來(lái)的脂肪酸可與鈣形成鈣皂沉淀，進(jìn)一步以鉛置換鈣，最后再經(jīng)硫化銨生成棕黑色硫化鉛沉淀?；钚圆课坏娜旧鶕?jù)重氮鹽的不同而不同，堅(jiān)牢紅 TR為紫紅色，堅(jiān)牢藍(lán) RR為青銅色。 （三）、光鏡顯示方法 偶氮色素法（偶聯(lián)偶氮色素法） 由于使用不同的重氮鹽，具體方法也不相同，現(xiàn)分述如下： (1) 萘酚 AS乙酸鹽（ Naphthol AS acetate）法 1）孵育液的配制： 1％ 萘酚 AS乙酸鹽 （ 丙酮溶液 ） （ pH ） 10ml 堅(jiān)牢藍(lán) B鹽 30mg （ 攪拌過(guò)濾使用 ） 2）方法與步驟： ① 新鮮組織恒冷箱切片，適當(dāng)固定； ② 入孵育液，室溫或 37℃ 恒溫孵育 20~30分鐘 ③ 流水輕沖洗 2分鐘； ④ 2％甲基綠復(fù)染細(xì)胞核； ⑤ 流水沖洗 3~5分鐘； ⑥甘油明膠封固。－甘油磷酸鈉作底物。 (4)結(jié)果與評(píng)價(jià) : 硫化鈷黑色沉淀為酶活性所在部位。 （ 2） 孵育液的配制： 三磷酸腺苷鈉鹽 60mg 4ml 蒸餾水 2ml CaCl2 2ml 2,4－二硝基苯酚 30mg （ 1）方法與步驟： ① 新鮮組織 ,冰凍切片； ② 入孵育液，恒溫 37℃ 孵育 20~40分鐘
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