【正文】 木桶效應(yīng) 何謂限制性基質(zhì) 115 比如：在培養(yǎng)大腸桿菌中分別設(shè)置不同濃度的葡萄糖(2%、 4%、 6%和 8%)，葡萄糖濃度變化對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)產(chǎn)生了影響，那么就說(shuō)葡萄糖為此菌生長(zhǎng)的限制性底物。 XXXdtdE ?????? ???? )(dE/dt：產(chǎn)酶速率 μ： 細(xì)胞比生長(zhǎng)速率 X： 細(xì)胞濃度 α： 與細(xì)胞生長(zhǎng)偶聯(lián)的產(chǎn)酶系數(shù) β ： 與 細(xì)胞生長(zhǎng)非偶聯(lián)的產(chǎn)酶系數(shù) 107 不同的產(chǎn)酶模式所對(duì)應(yīng)的產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)方程形式也有所不同 主要分為三型： 生長(zhǎng)偶聯(lián)型 部分生長(zhǎng)偶聯(lián)型 非生長(zhǎng)偶聯(lián)型 108 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián) x p 同步合成型 XXdtdE ????? ??? )(α≠ 0、 β= 0 109 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)相偶聯(lián) x p 中期合成型 XXdtdE ????? ??? )(α≠ 0、 β= 0 產(chǎn)酶前期： 阻遏作用，不產(chǎn)酶 產(chǎn)酶后期： 產(chǎn)酶與生長(zhǎng)相偶聯(lián) 110 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)部分偶聯(lián) x p 延續(xù)合成型 α≠ 0、 β ≠ 0 XXXdtdE ?????? ???? )(111 產(chǎn)物的形成和菌體的生長(zhǎng)非偶聯(lián) x p 滯后合成型 α= 0、 β ≠ 0 XXdtdE ???? ??? )(產(chǎn)酶前期： 阻遏作用，不產(chǎn)酶 產(chǎn)酶后期： 產(chǎn)酶與生長(zhǎng)非偶聯(lián) 112 本章內(nèi)容 一、酶生物合成基本理論 三、酶的發(fā)酵工藝條件及控制 四、酶生產(chǎn)過(guò)程的動(dòng)力學(xué) 二、產(chǎn)酶微生物 113 本章重點(diǎn)掌握內(nèi)容 1. 酶的調(diào)節(jié)理論（產(chǎn)物阻遏與分解代謝物阻遏） 2. 從自然界中獲取產(chǎn)酶微生物的基本步驟 3. 發(fā)酵工藝條件控制有哪些參數(shù)需要控制？有何影響，如何產(chǎn)生，如何解決？ 4. 四種產(chǎn)酶模式 114 一種營(yíng)養(yǎng)成分要成為限制性基質(zhì)的前提條件是其他營(yíng)養(yǎng)物必須過(guò)量。 因此人們針對(duì)不同情況又提出了另外一些方程， 但最終目的只有一個(gè)： 就是利用建立起來(lái)的動(dòng)力學(xué)方程來(lái)控制和優(yōu)化發(fā)酵生產(chǎn)。 102 3. 整理試驗(yàn)數(shù)據(jù)，求出 Monod方程 smmS KS??? ??S(mg/L) 6 33 64 153 μ(h1) 原始數(shù)據(jù) 整理數(shù)據(jù) S/μ(y) 100 S (x) 6 33 64 153 ( y = ax + b ) 通過(guò)第 2步得到一個(gè)基質(zhì)濃度（ S）對(duì)應(yīng)的一個(gè)比生長(zhǎng)速率（ μ） 103 μm ＝ (h1)。 smmS KS??? ??S/μ S ( y = ax + b ) 當(dāng) x=0時(shí)，y=Ks/μm 當(dāng) Y=0時(shí)， x=b/a=Ks Ks/μm Ks 99 實(shí)例分析計(jì)算 1. 設(shè)定不同濃度的限制性基質(zhì)濃度，培養(yǎng)細(xì)菌，得到相關(guān)細(xì)胞數(shù)量的試驗(yàn)數(shù)據(jù) 100 2. 選定對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的幾組數(shù)據(jù)，得到不同基質(zhì)濃度與比生長(zhǎng)速率的線性回歸方程，求出對(duì)應(yīng)的比生長(zhǎng)速率。 ? 當(dāng)限制性基質(zhì)的濃度 SKs時(shí)，增加基質(zhì)濃度就不能提高細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。 95 Monod方程 1950年，法國(guó)的莫諾德 (Monod)首先提出了表述微生物細(xì)胞生長(zhǎng)的動(dòng)力學(xué)方程，用以反映 限 制性 基質(zhì)濃度與細(xì)胞生長(zhǎng)速率 的關(guān)系 ： μm：為最大比生長(zhǎng)速率 S： 限制性基質(zhì)的濃度 KS ：莫諾德常數(shù) μ 010 200 400 600 800 1000SVV mV m /2K m限制性基質(zhì)濃度 (S) 比生長(zhǎng)速率 (μ) KS 96 ? 當(dāng)限制性基質(zhì)的濃度 SKs時(shí)，增加基質(zhì)濃度可提高細(xì)胞比生長(zhǎng)速率。 dxdt?0? maxXX衰亡期 : dxdt?0dX dt μmax 對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的 μ為 常數(shù) ，且在生長(zhǎng)過(guò)程中比生長(zhǎng)速率 最大 ；它決定了最終細(xì)胞產(chǎn)量的多少，即 μ對(duì)數(shù)期 越大，則細(xì)胞產(chǎn)量越大。 92 在細(xì)胞生長(zhǎng)過(guò)程中，通常利用比生長(zhǎng)速率 (μ)來(lái)描述細(xì)胞的生長(zhǎng)速度； 比生長(zhǎng)速率 定義為單位時(shí)間內(nèi)單位菌體增加的物質(zhì)的量或菌體數(shù)量。利用數(shù)學(xué)模型來(lái)描述并分析細(xì)胞生長(zhǎng)規(guī)律的方法稱為細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)。 ? 細(xì)胞的 生長(zhǎng)速率 與環(huán)境因素對(duì)其的影響稱為 細(xì)胞生長(zhǎng)動(dòng)力學(xué)； ? 產(chǎn)酶速率 及環(huán)境因素對(duì)其的影響稱為 產(chǎn)酶動(dòng)力學(xué)。 總結(jié) 組成型酶 不存在阻遏作用，屬于同步合成或延續(xù)合成型 誘導(dǎo)型酶 則視培養(yǎng)基中有無(wú)阻遏物而屬于不同類型 87 因素 1： mRNA的穩(wěn)定性 不穩(wěn)定 穩(wěn)定 因素2：培養(yǎng)基中阻遏物 有阻遏 無(wú)阻遏 中期合成型 同步合成型 延續(xù)合成型 滯后合成型 88 理論應(yīng)用 目的：提高產(chǎn)酶率和縮短發(fā)酵周期 最理想的合成模式：延續(xù)合成型 策略措施： 提高 mRNA的穩(wěn)定性： 菌株選育；降低產(chǎn)酶溫度 解除阻遏： 培養(yǎng)基中解除阻遏物；變誘導(dǎo)型為組成型 89 ? 對(duì)于同步合成型的酶，要盡量提高其對(duì)應(yīng)的mRNA的穩(wěn)定性；可適當(dāng) 降低發(fā)酵溫度 ? 對(duì)于滯后合成型的酶，要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物的濃度 ，盡量減少甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用； 補(bǔ)料添加等 ? 對(duì)于中期合成型的酶，則對(duì) mRNA的穩(wěn)定性和解阻遏兩方面進(jìn)行改進(jìn)。 種類：誘導(dǎo)酶 1 2 85 1. 何時(shí)開始產(chǎn)酶 2. 穩(wěn)定期后是否繼續(xù)產(chǎn)酶 86 mRNA的穩(wěn)定性、培養(yǎng)基中阻遏物的存在是影響酶生物合成模型的主要因素。 種類：大部分組成酶和部分誘導(dǎo)酶 1 2 84 滯后合成型 酶合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，酶可繼續(xù)合成一段時(shí)間。 種類：大部分組成酶和部分誘導(dǎo)酶 1 2 83 中期合成型 酶合成在細(xì)胞生長(zhǎng)一段時(shí)間以后才開始，而在細(xì)胞進(jìn)入穩(wěn)定期后，酶的合成也隨著停止。 種類：大部分組成酶和部分誘導(dǎo)酶 1 2 82 延續(xù)合成型 酶的生物合成在細(xì)胞的生長(zhǎng)階段開始，在細(xì)胞生長(zhǎng)進(jìn)入平衡期后，酶還可以延續(xù)合成一段較長(zhǎng)時(shí)間。 81 同步合成型 酶的生物合成與細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行 的一種酶生物合成模式， 又稱為 生長(zhǎng)偶聯(lián)型 。 由細(xì)胞生長(zhǎng)和酶產(chǎn)生的關(guān)系 , 將酶生物合成的模式分為 4種類型。 例如，添加一定量的植酸鈣鎂，可使霉菌蛋白酶的產(chǎn)量提高 1～ 20倍； 產(chǎn)酶促進(jìn)劑對(duì)不同細(xì)胞、不同酶的作用效果各不相同，現(xiàn)在還沒有規(guī)律可循，要通過(guò)試驗(yàn)確定促進(jìn)劑的種類和濃度。 細(xì)胞內(nèi)酶含量達(dá)到一定程度后會(huì)被胞內(nèi)蛋白酶降解，加入表面活性劑可以增加細(xì)胞膜透性，從而使酶未被分解即分泌到胞外，增加酶的產(chǎn)量。 控制產(chǎn)物阻遏的方法： 從培養(yǎng)基中去除終產(chǎn)物；或加入某個(gè)抑制因子，阻斷代謝途徑限制末端產(chǎn)物積累，如組氨酸合成酶生產(chǎn)中加入 α噻唑丙氨酸。 例如，乳糖誘導(dǎo) β半乳糖苷酶，纖維二糖誘導(dǎo)纖維素酶等。 ? 另一方面，可以避免發(fā)酵中一次投料過(guò)多造成細(xì)胞大量生長(zhǎng)所引起的溶解氧不足、發(fā)酵液粘稠等影響。降低葡萄糖用量，從 8%降低至 6%，補(bǔ)加 2%氨基乙酸，部分解除阻遏作用，提高酶活 26% 74 基質(zhì)濃度的控制 － 補(bǔ)料 在發(fā)酵培養(yǎng)的過(guò)程中，間歇或連續(xù)的補(bǔ)加新鮮培養(yǎng)基的方法。 ? 高濃度基質(zhì)引起碳分解代謝物阻遏現(xiàn)象。 73 5. 基質(zhì)濃度 基質(zhì)濃度的影響： 培養(yǎng)基營(yíng)養(yǎng)成分過(guò)低，影響微生物生長(zhǎng)和產(chǎn)酶； 培養(yǎng)基過(guò)于豐富，微生物生長(zhǎng)過(guò)旺，導(dǎo)致發(fā)酵液粘稠改變?nèi)苎趿俊? 泡沫的影響： ? 阻礙 CO2的排除，影響氧的溶解； ? 溢罐，導(dǎo)致浪費(fèi)原料，引起染菌； ? 裝液量減少，降低發(fā)酵罐的利用率。 發(fā)酵過(guò)程中溶氧無(wú)需達(dá)到飽和，只要求超過(guò) “臨界氧濃度” 。 各種微生物對(duì)發(fā)