【文章內容簡介】 純培養(yǎng)，另有 95%以上的菌株是不能利用純培養(yǎng)的，稱為不可培養(yǎng)微生物(VBNC， viable but non culturable)。這是生物資源的巨大寶庫，如何獲取這些微生物的資源？ 宏基因組策 略 (Metagenome) 43 基因文庫的建立 細胞 A 提取總 DNA 核酸酶處理成小片段 把小片段與基因載體連接，導入宿主體中，使穩(wěn)定遺傳。 其 總和稱為細胞 A的基因文庫 …… 每個平板得到的純培養(yǎng)菌都含有一段細胞 A的DNA小片段 基因倉庫 宏基因組策略 環(huán)境樣品 （土壤或水樣等） 44 3. 常見的產(chǎn)酶微生物 ? 目前工業(yè)主要用酶： 蛋白酶占 59%、糖化酶 13%、 α淀粉酶 5%、葡萄糖異構酶 6%、果膠酶 3％、脂肪酶 3%、其他醫(yī)藥與分析研究用酶占 10%。 ? 主要用于生產(chǎn)的微生物： 細菌： 大腸桿菌、枯草芽孢桿菌 放線菌： 鏈霉菌 霉菌： 曲霉、根霉 45 (1) 大腸桿菌 (Escherich coli) 大腸桿 菌產(chǎn)酶一般都屬于 胞內酶 ，所以通常需要經(jīng)過細胞破碎才可分離； ? 由于遺傳背景清楚，常作為基因工程菌的宿主。 ? 限制性核酸內切酶、 DNA聚合酶、 DNA連接酶、核酸外切酶等的主要來源。 ? 工業(yè)生產(chǎn)青霉素酰化酶、 β半乳糖苷酶、谷氨酸脫羧酶和天冬酰胺酶等； 46 (2)枯草桿菌 （ Bacillus subtilis） 枯草芽孢桿菌是 工業(yè)上應用最廣泛的 產(chǎn)酶微生物之一，所生產(chǎn)的 α淀粉酶和蛋白酶等都是 胞外酶 ； ? 主要生產(chǎn) α淀粉酶，蛋白酶， β葡聚糖酶，堿性磷酸酶等；枯草桿菌 BF7658 是國內用于生產(chǎn) α淀粉酶的主要菌株。 47 (3) 放線菌 放線菌是具有分支狀菌絲的單細胞原核微生物 ， 常用于酶發(fā)酵生產(chǎn)的放線菌主要是 鏈霉菌 。 主要應用：鏈霉菌是生產(chǎn) 葡萄糖異構酶 的主要微生物。還可以用于生產(chǎn) 青霉素?；?、纖維素酶等 。 48 (4) 曲霉 (Aspergillus) 主要應用： 蛋白酶、淀粉酶、果膠酶 等。 (5) 根霉 (Rhizopus) 主要應用： 淀粉酶、纖維素酶、果膠酶、脂肪酶 等； 49 本章內容 一、酶生物合成基本理論 三、酶的發(fā)酵工藝條件及控制 四、酶生產(chǎn)過程的動力學 二、產(chǎn)酶微生物 50 酶發(fā)酵生產(chǎn)的工藝流程 活 化 擴大培養(yǎng) 保藏菌種 培養(yǎng)基 發(fā)酵產(chǎn)物 發(fā)酵生產(chǎn) 種子菌液 51 ? 活化：把處于休眠狀態(tài)的菌株喚醒，使其 恢復生命活性； ? 擴大培養(yǎng)（種子菌液）：活化好的菌體經(jīng)過擴大培養(yǎng)獲得 下一級發(fā)酵罐所需的接種量 ； ? 擴大培養(yǎng)的培養(yǎng)基要與發(fā)酵罐中的培養(yǎng)基 成分接近 ； N源豐富 ，利于細胞生長。 ? 選用 對數(shù)生長期 的菌液，活力最強，適應環(huán)境能力最強；菌齡過年輕發(fā)酵周期延長、菌齡過老導致生產(chǎn)力減弱。 ? 適中。過少，發(fā)酵周期延長；過大，菌體生長太快會造成培養(yǎng)基粘稠，影響培養(yǎng)基溶氧量。一般為 1% ~ 10%較為適宜。 BACK 對制備種子菌液的要求： 培養(yǎng)基 種齡 接種量 52 培養(yǎng)基： 培養(yǎng)不同的微生物必須采用不同的培養(yǎng)條件； 培養(yǎng)目的不同，原料的選擇和配比不同； 不同生長階段，所要求的培養(yǎng)條件也有所差異。 一般都包括 水、碳源、氮源、無機鹽和生長因子 五大組分。 53 1. 水 ? 水是細胞的主要組成部分； ? 水是細胞內生化反應的介質； ? 作為營養(yǎng)物質和代謝產(chǎn)物的良好溶劑； ? 水的比熱高，熱傳導性好，避免細胞內溫度發(fā)生驟變。 54 2. 碳源 碳是微生物細胞需要量最大的元素 作用： ? 提供碳素； ? 碳源物質代謝產(chǎn)生 ATP供能 種類來源： 有簡單的無機含碳 化合物 (CO NaHCO3)；復雜的有機物 (糖、烴類、醇等 )；生物大分子 (蛋白質、氨基酸和核酸 )；復雜的天然含碳物（牛肉膏、蛋白胨、花生餅粉）等 55 ? 根據(jù)不同的微生物特性選擇特定的 C源營養(yǎng)物 。 異養(yǎng)型微生物 ， 糖類是最好的 C源 ， Glu最為通用 。 ? 根據(jù)酶調節(jié)理論 （ 合成誘導作用 、 分解物代謝阻遏作用 ） ， 對所產(chǎn)酶的特性做出了解并調整碳源成分 。 生產(chǎn)應用： 56 3. 氮源 氮 是微生物細胞需求量僅次于碳的元素。 作用： ? 提供氮素，蛋白質和核酸的主要元素 種類來源： 有機氮源 主要是各種蛋白質及其水解產(chǎn)物，如蛋白胨，酵母膏，牛肉膏，豆餅粉，花生餅粉等； 無機氮源 是各種含氮的無機化合物，主要是銨鹽（如硫酸銨，磷酸銨，硝酸銨等）和硝酸鹽； 57 碳氮比一般是指培養(yǎng)基中碳元素與氮元素之比 。 生產(chǎn)應用 (C/N)： 擴大培養(yǎng)中， N源含量要求較高 發(fā)酵生產(chǎn)中，一般把培養(yǎng)基的 N源適當下調。 一般而言： N源含量較高 （ C/N低 ） 有 利于微生物的生長和繁殖 ；反之 ， N源含量較低 （ C/N高 ） 微生物生長不會特別旺盛而 利于代謝產(chǎn)物的積累 。 58 4. 無機鹽 微生物除了需要 C源、 N源外，還需要 P、 S、 K、 Ca、Mg、 Cu等元素，它們大多都是以無機鹽的形式提供的。 作用： ? P和 S分別是核酸和含硫氨基酸的組成成分； ? Fe、 Mg、 Cu、 Zn等作為許多酶的激活劑； ? Na和 K具有調節(jié)細胞滲透壓的作用，磷酸鹽組成緩沖劑可保持微生物在生長過程中的 pH穩(wěn)定。 59 種類來源： ? 無機元素是通過在培養(yǎng)基中添加無機鹽來提供的 ， 采用添加水溶性的硫酸鹽 、 磷酸鹽 、 鹽酸鹽或硝酸鹽等； ? 一般微量元素在配制培養(yǎng)基所使用的水中已經(jīng)足量 ，無需特意添加 。 60 5. 生長因子 生長因子是指微生物生長需求量很少 ， 但卻自身不能合成的或者合成量不夠的有機化合物 。 分為維生素 、 氨基酸和嘌呤嘧啶三大類 。 作用： ? 氨基酸是蛋白質的組分； ? 嘌呤、嘧啶是核酸和某些輔酶或輔基的組分； ? 維生素主要起輔酶作用（ B1硫胺素為脫羧酶的輔基、煙酸為 NAD和 NADP的前體，脫 H酶的輔酶等）。 61 種類來源： ? 酵母膏 、 蛋白胨 、 牛肉膏 、 麥芽汁 、 米曲汁等天然培養(yǎng)基中本身含有各種生長因子 。 ? 多數(shù)真菌 、 放線菌和細菌是可以自身合成生長因子的 ，所以在培養(yǎng)基的配制中是不需要另外加入生長因子的； 但一些生長因子合成能力較差的細菌 （ 如乳酸菌 ） ， 需要額外加入一些維生素 、 氨基酸等作為補充 。 62 請指出培養(yǎng)基中的營養(yǎng)成分 牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：（細菌） 牛肉膏、蛋白胨、 NaCl 察氏培養(yǎng)基 ：（霉菌） 蔗糖 、硝酸鈉 、磷酸氫二鉀 、硫酸鎂 、氯化鉀 、硫酸亞鐵 高氏培養(yǎng)基：（放線菌） 淀粉、硝酸鉀、磷酸氫二鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硫酸亞鐵 生長因子？ 63 發(fā)酵生產(chǎn)考慮： 工業(yè)生產(chǎn)中考慮更多的是如何低成本獲取高價值，所以在培養(yǎng)基選材方面主要以低成本的原料為主。 產(chǎn)酶角度考慮： 培養(yǎng)基是否有利于酶的產(chǎn)生。 BACK 產(chǎn)酶培養(yǎng)基的一般原則： 培養(yǎng)基配方： 查找文獻 —— 優(yōu)化和改進。 64 發(fā)酵條件的控制 1. pH值 2. 溫度 3. 溶氧量 4. 泡沫 5. 基質濃度 65 1. pH值 pH對發(fā)酵的影響： 不同微生物的生長最適 pH值不同（細菌、放線菌、霉菌）。 改變細胞內酶的活性； 影響細胞膜的透性； 影響培養(yǎng)基營養(yǎng)成分解離狀態(tài)。 產(chǎn)酶 pH通常與這個酶的最適反應 pH一致， 可以通過控制 pH來控制不同酶的產(chǎn)量；此外，也受到菌體自身生長的影響。 66 影響 pH變化的因素： 發(fā)酵過程中 pH的變化主要是由細胞產(chǎn)酸產(chǎn)堿代謝反應的綜合結果： ? pH下降： 碳源氧化不完全，使有機酸大量積累； 生理酸性鹽（如硫酸氨）中的氨被菌體利用后，殘留的硫酸根離子會導致發(fā)酵液。 ? pH上升： 培養(yǎng)基中蛋白質和含氮有機物被水解后放出氨。 67 控制 pH值： ? 調整培養(yǎng)