免疫標(biāo)記技術(shù)ppt課件(參考版)
2024-11-06 17:36本頁面
【正文】 。該法除可濃縮濃度極低的抗原，還可在電泳和免疫印跡前將其與無關(guān)蛋白質(zhì)分離，使對極低濃度抗原的研究成為可能。電泳時樣品上樣量影響條帶形狀，如果上樣量過大條帶會發(fā)生扭曲變形。若有可能，再設(shè)置一個不含待測抗原的細(xì)胞裂解液對照（例如來源于含無效基因的細(xì)胞）更利于解釋結(jié)果。它可提示免疫印跡是否成功，并能精確比較抗原的相對分子量；如果陽性對照中抗原量已知，可粗略估計出待測樣品中抗原的含量。 ? 設(shè)置對照與解釋結(jié)果 ? 免疫印跡從細(xì)胞裂解液開始就需設(shè)置兩組對照，包括含有已知抗原的陽性對照樣品和能與陰性對照抗體發(fā)生反應(yīng)的細(xì)胞裂解物。此時可降低分離膠的濃度。 ? 另外，兩電極之間的任何直接連接，在濾紙／凝膠／轉(zhuǎn)印膜／濾紙夾層組合內(nèi)存在的氣泡也會在局部阻止轉(zhuǎn)印過程。為了使轉(zhuǎn)印有效進行，必須在電極和濾紙／凝膠／轉(zhuǎn)印膜／濾紙夾層組合之間保持良好的電流通路并保證整個電極表面電流分布均勻。由于這種類型的污染是特異的，不可能用降低非特異性背景的一般方法來解決。其中有針對各種細(xì)胞成分的自身抗體及針對侵入動物體內(nèi)的微生物產(chǎn)生的抗體，這些抗體既有新近產(chǎn)生的，也有在采血之前產(chǎn)生的，還有在免疫動物時污染的其他抗原刺激產(chǎn)生的抗體。其來源一般有兩種：一種是由于制劑中存在的非特異性抗體產(chǎn)生的背景條帶，另一種則是由于特異性抗體與含有與待測抗原類似表位的多肽發(fā)生的交叉反應(yīng)。 ? 背景問題 ? 背景高和非特異性條帶可能是由于抗體制劑中存在與印跡膜上其他蛋白質(zhì)結(jié)合的抗體（非特異性抗體）。含量極低的蛋白在進行電泳之前需用免疫沉淀等方法純化，這樣能夠擴大免疫印跡檢測范圍。 ? 樣品中待檢測蛋白質(zhì)的含量 ? 影響免疫印跡實驗的因素之一是蛋白質(zhì)原液中抗原的濃度。多數(shù)多克隆抗血清中含有這種類型的抗體，所以常用于免疫印跡實驗中。 ? Western Blot顯色的方法主要有以下幾種： ? ①放射自顯影 ? ②底物化學(xué)發(fā)光 ? ③底物熒光 ? ④底物 DAB呈色 免疫印跡 ? 免疫印跡中需要注意的問題 ? 抗體性質(zhì) ? 樣品中待測蛋白質(zhì)的含量 ? 背景問題 ? 轉(zhuǎn)印效率低 ? 設(shè)置對照與結(jié)果解釋 ? 免疫印跡技術(shù)的靈敏度 ? 抗體的性質(zhì) ? 影響免疫印跡成敗的一個主要因素是抗原分子中表位的性質(zhì)。再通過抗體與膜上抗原的特異性結(jié)合來定位抗原。印跡膜上有非特異性吸附蛋白質(zhì)的位點，因此需進行 封閉 以防免疫試劑的非特異性吸附。這兩種轉(zhuǎn)印的裝置效果均較好，可根據(jù)實驗室條件來選擇。有兩種方法：一種是濕轉(zhuǎn)印法，即將凝膠膜夾層組合完全浸入轉(zhuǎn)印緩沖液中；另一種是半干轉(zhuǎn)印法，即將凝膠 膜夾層組合放在浸有轉(zhuǎn)印緩沖液的吸水紙之間。目前常用方法是電洗脫或電印跡。以硝酸纖維素膜最為常用，優(yōu)點是：結(jié)合能力強，膜不需要活化，背景淺，能進行多次免疫檢測并可用常規(guī)染色方法，功能基團壽命長等，缺點是易破碎。另外樣品處理液中也可加入適量甘油或蔗糖以增大溶液密度 ,使加樣時樣品溶液可以沉入樣品加樣槽底部。通常，應(yīng)根據(jù)目的選擇厚度、大小均適合的凝膠。一般情況下，丙烯酰胺和交聯(lián)劑的比例越低，轉(zhuǎn)移就越易進行。由于不連續(xù)緩沖系統(tǒng)具有把樣品中的成分全部濃縮于很小體積的能力，故大大提高了 SDSPAGE電泳的分辨率。 免疫印跡步驟 ? 蛋白質(zhì)的電泳分離： ? 十二烷基硫酸鈉 聚丙烯酰胺凝膠電泳 （ SDSPAGE）是最常用的定性分析蛋白質(zhì)的電泳方式，通常在不連續(xù)緩沖系統(tǒng)中進行，其電泳緩沖液的 PH值與離子強度不同于制膠緩沖液，當(dāng)兩電極間接通電流后．凝膠中形成移動界面，并帶動加入凝膠的樣品中所含的 SDS多肽復(fù)合物向前推進。免疫印跡的優(yōu)點是能分析不能用其他免疫化學(xué)技術(shù)進行研究的蛋
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