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定量pcr基本原理及方法(參考版)

2025-05-19 01:36本頁面
  

【正文】 片段預先進行 40個循環(huán)的快速擴增 ( 40分鐘 ) 。 上圖:用內摻式染料 ( 無探針 ) 區(qū)分 ACTIN3( R577X) SNP基因型 ( C到 T替代 ) 。 ? 利用熔解曲線檢測基因突變 雜合型 野生型 突變型 利用內摻式染料進行高分辨率熔解曲線 ( HRM) 分析基因型 HRM根據(jù)序列長度 、 GC含量和互補性分析樣品 , 可精確到單堿基差異 。 通過實時捕捉到的 PCR產(chǎn)物在熔解過程中熒光信號的變化 , 得到 PCR產(chǎn)物的熔解曲線 。 如果只有一種信號被擴增出來 , 則樣本為對應的基因型 ( 野生型或突變型 ) 的純合子;如二者都被有效地擴增出來 , 則樣本為雜合型 。 ? Ct值 與起始模板的關系 Y軸 —Ct值 X—起始拷貝數(shù)的對數(shù) 標準曲線 ? 由系列稀釋的已知濃度的樣品做標準曲線 ? 計算待測樣品的初始模板濃度 log N0 =Ct logE+logN ? 絕對定量 —— 未知濃度的樣品與標準曲線相比較 ? 內摻式染料 SYBR Green I, LC Green ? 序列特異性探針 Taqman Molecular Beacons FRET ? 引物特異性探針 Amplifluor (Intergen) LUX 二. 熒光定量 PCR 標記方法 5’ 3’ 5’ 3’ SG Excitation SG SG SG SG Emis
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