【正文】 donnell PJ, Calvert C, Atzorn R. Ethylene as a signal mediating the wound response of tomato plants[J].Science,1996,274:19141917. [3]孫清鵬，王小普 .植物傷反應(yīng)在的茉莉酸類信號 [J].植物學(xué)通報(bào)， 2020，20(4):481488. [4]Pearce G, Strydom D, Johnson S, et al. A polypeptide from tomato leaves induces wound inducible proteinase inhibitor proteins[J]. Science,1991,253:895898. [5]張洪，黃建韶 . 馬鈴薯中多酚氧化酶的酶學(xué)特性研究 [J]. 食品工業(yè)科技，2020, 4（ 23）： 3941. [6]Dombrowski JE, Pearce G, Ryan CA. 1999. Proteinaseinhibitor inducing activity of the prohormone prosystemin resises exclusively in the Cterminal systemin domain[J]. Proceedings of the National Academy of Sciences， USA,1999,96:1294712952. [7]簡令成 ,王紅 . Ca2+在植物細(xì)胞對逆境反應(yīng)和適應(yīng)中的調(diào)節(jié)作用 [J].植物學(xué)通報(bào) , 2020, 25(3): 255267. [8]Li L, Li C, Lee GI et al也祝各位老師， 身體健康 萬事如意。 在此 還要感謝所有教導(dǎo)過我的老師，感謝你們在大學(xué) 期間 間對我人生觀、價(jià)值觀的引導(dǎo)。 綜上所述，經(jīng)過醇誘導(dǎo)后有關(guān)植物防御反應(yīng)的相關(guān)基因的表達(dá)量都會相應(yīng)的上調(diào)，而由于不同酶的特性使他們的表達(dá)的時(shí)間和表達(dá)量會有些不同。 結(jié)果表明隨著香葉醇誘導(dǎo)的時(shí)間 延 長，經(jīng)過香葉醇誘導(dǎo)的 PS 基因的表達(dá)量越低；隨著葉醇誘導(dǎo)的時(shí)間 越長，經(jīng)過葉醇誘導(dǎo)的 PS 基因的表達(dá) 量越高，同時(shí) 香葉醇和葉醇浸泡組的 PS 基因 表達(dá)量 最高。 LOX 基因 屬于早期基因，隨著香葉醇或葉醇處理的時(shí)間 延 長，經(jīng)過醇誘導(dǎo)的 LOX 基因的表達(dá) 量越低。 噴施時(shí)間相同和浸泡的時(shí)間相同 的 情況下，與 香葉醇 相比，葉醇處理對果實(shí)的傷害作用更為明顯，引發(fā)了更多的 多酚氧化酶 活性的提高。關(guān)于植物誘導(dǎo)抗蟲性的基本特征、理化機(jī)制和對昆蟲及其天敵的影響 ,松樹誘導(dǎo)抗蟲性機(jī)制 ,外源茉莉酸類物質(zhì)誘導(dǎo)的植物抗蟲性及作用機(jī)理 ,昆蟲誘導(dǎo)的植物蛋白酶抑制劑和揮發(fā)性化合物國內(nèi)已有一些研究，但醇誘導(dǎo)對植物的傷害作用的研究少見報(bào)道。 結(jié)果表明 隨著香葉醇或葉醇處理的時(shí)間越長，經(jīng)過醇誘導(dǎo)后的 inhII 基因的表達(dá) 量越高。葉醇處理 3d 時(shí)，其相應(yīng)的 inhII 基因 相對表達(dá)量是葉醇處理 1d 的 倍。受損傷誘導(dǎo)的 PIN 基 因主要有半胱氨酸蛋白酶抑制劑 CPIN、絲氨酸蛋白酶抑制劑 SPIN 和胰島素蛋白酶抑制劑 TPIN 基因。 Ryan,1981)，且這種積累是局部和系統(tǒng)性的 (Cordero et al.,1994)。 PIN 抑制昆蟲消化性蛋白酶，導(dǎo)致昆蟲由于饑餓而生長遲緩和死亡。 結(jié)果表明隨著香葉醇誘導(dǎo)的時(shí)間越長，經(jīng)過香葉醇誘導(dǎo)的 PS 基因的表達(dá) 量越低；隨著葉醇誘導(dǎo)的時(shí)間越長，經(jīng)過葉醇誘導(dǎo)的 PS 基因的表達(dá) 量越高，同時(shí) 香葉醇和葉醇浸泡組的 PS 基因 表達(dá)量 最高。葉醇處理 3d 時(shí)，其相應(yīng)的 PS 基因 相對表達(dá)量是葉醇處理 1d 的 倍。 醇誘導(dǎo) 對 PS 基因表達(dá) 的影響 原系統(tǒng)素蛋白（ PS） 與植物損傷后系統(tǒng)的防御反應(yīng)有關(guān)，該基因的相對表達(dá)量會在植物防御時(shí)相應(yīng)的增加。香葉醇和葉醇浸泡組的 CDI 基因 相對表達(dá)量分別是葉醇處理 1d 的 和 倍。 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 29 圖 5 醇誘導(dǎo)對 CDI 基因表達(dá)的影響 從 圖 5 可以看出，與 葉醇處理番茄果實(shí) 1d 后的 CDI 基因 表達(dá)相比，香葉醇處理 1d 和 3d 時(shí)，其相應(yīng) 的 CDI 基因 相對表達(dá)量是 和 ，是葉醇處理 1d時(shí)的 和 倍。 結(jié)果表明 LOX 屬于早期基因，隨著香葉醇或葉醇處理的時(shí)間延長，經(jīng)過醇誘導(dǎo)的 LOX 基因表達(dá) 量越低。葉醇處理 3d 時(shí)，其相應(yīng)的 LOX 基因 相對表達(dá)量占葉醇處理1d 的 2%。 可見 LOX 基因的表達(dá)水平與植物的防御反應(yīng)相關(guān)。在番茄葉片上， TomLOXD 基因的表達(dá)可由損傷誘導(dǎo)， TomLOXD 解碼的葉綠體 LOX 是類西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 28 十八烷防御信號途徑 的一個(gè)組成成分，在植物的害蟲防御中起作用 (Heitz et al., 1997)。如在 Arabidopsis(Belland Mullet, 1993)、大豆 (Sarawitz and Siedow, 1996)、 馬鈴薯 (Royo et al., 1996)上的 LOX mRNA 積累可由昆蟲攻擊引起。 醇誘導(dǎo) 對 LOX 基因表達(dá) 的影響 脂肪氧合酶（ lipoxygenase, LOX）基因是真核細(xì)胞中普遍存在的酶， 能 將長鏈不飽和脂肪酸氧化成它們的過氧化合物。 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 27 醇處理對防御相關(guān)基因 LOX, CDI, PS, inhII表達(dá) 的影響 熒光定量 PCR 擴(kuò)增效率、相關(guān)系數(shù)和溶解曲線 圖 3 基因的擴(kuò)增曲線 在熒光定量 PCR 儀上， 通過 熒光定量 PCR 獲得了基因的擴(kuò)增曲線。 盡管在 410nm 下測定的 PPO 酶活性，在數(shù)值上與在 525nm 下測定值存在較大的差異，但整體的趨勢是一致的，表明這兩個(gè)吸收波長均可被用來測定 PPO 酶活性的變化。葉醇處理1d 和 3d 時(shí)， 多酚氧化酶比活性 (410nm 波長下 )為 和 ，分別是對照組的 和 倍；而 香葉醇處理 1d 和 3d 后測得 的多酚氧化酶比活性 僅是對照組的 和 倍。將果實(shí)切片直接暴露在醇溶液中測定的 多酚氧化酶比活性 為 和 ，對 PPO 酶活性的誘發(fā)明顯高于噴施處理。 圖 1 香葉醇和葉醇 誘導(dǎo) 下番茄果實(shí)的 PPO 比活性 （ 525nm 波長） 從 圖 1 可以看出，與未處理的對照相比， 噴施 10mM 香葉醇 和葉醇均引起多酚氧化酶活 性的提高，且隨處理時(shí)間的延長，酶活性也明顯增加。在本實(shí)驗(yàn)中，通過 波長掃描 ，確定了兩個(gè)波長 410 和 525nm 下，均存在較高的吸收峰。 研究已經(jīng)表明， PPO 含量和活性是組織產(chǎn)生褐化的內(nèi)在原因，它與植物的防御反應(yīng)有關(guān)。 PPO 在 pH 5～ 7 之間具有活性，但沒有明顯的最適 pH。 Reverse Primer (10 μ M) 1μ L cDNA 模板 1μ L RNasefree ddH2O 8μ L 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 25 第 3章 結(jié)果與分析 香葉醇和葉醇的誘導(dǎo) 對 番茄果實(shí)多酚氧化酶活性 影響 多酚氧化酶 (PPO)是 催化酚類氧化的各種酚酶 的總稱， 通常包括多酚氧化酶、絡(luò)氨酸酶和兒茶酚酶。 實(shí)驗(yàn)采用相對定量的方法，分析目的基因在樣品組與對照組間差異表達(dá)的倍數(shù)（ ）。 2） RealTime PCR 反應(yīng) : 用 RealMasterMix(SYBR Green)試劑 （ TIANGEN Biotech 公司）進(jìn)行，每組樣品重復(fù)三次。 C 10 min 滅活逆轉(zhuǎn)錄酶， 20176。 C 溫育 5 min，迅速置冰浴中，加樣如下： 1 μ L RNase Inhibitor 1 μ L dNTP (10 mmol/L) 8 μ L 5 buffer 1 μ L MMLV reverse transcriptase 混勻，短暫離心， 42176。 C 孵育 5 min， 以使 RNA 充分 溶解； 7) 取 5 μ L RNA 樣品進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測； 8) 取 5 μ L RNA 樣品，加 495 μ L 無 RNA 酶的 TE 緩沖液 (pH )稀釋后，用紫外分光光度計(jì)檢測樣品在 260nm 和 280nm 處的吸收值，分析其純度和濃度。倒掉上清液，用 75%的乙醇 1 mL 洗滌RNA 沉淀 12 次，旋渦振蕩混合樣品后， 4176。離心后混合物分成 3 層：下層紅色的為苯酚 氯仿層，中間層為細(xì)胞殘?jiān)?，上層無色的為水相層， RNA 存在于水相層中，水相層的容量大約為所加 TRIZOL 容量的 60%； 4) 將水相層轉(zhuǎn)移到 1 干凈的 mL Ep 管中，加入 mL 異丙醇，顛倒混西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 23 勻，將混勻后的樣品于室溫孵育 10 min； 5) 4176。 果實(shí) RNA 的提取 1) 取 80℃冰箱內(nèi)保存 的處理過的番茄 果實(shí) 24 克，加入液氮研磨成粉狀，迅速轉(zhuǎn)移 100200mg 粉末于不含 RNase 的 mL Ep 管中，即刻加入 1 mL TRIZOL， 在 vortex 上振蕩 10s，然后將勻漿樣品在室溫孵育 5 min 以使核蛋白體完全分解； 2) 加 mL 氯仿，蓋緊 Ep 管蓋，用手劇烈振蕩 15 s 并于室溫孵育 23 min； 3) 4176。 C 過夜并高壓滅菌。 SDS 及 Tris 溶 液：取新開封的藥品，用 DEPC 處理過并經(jīng)高壓滅菌的水配 制。 水：將水加入無 RNA 酶的玻璃瓶中，加入 DEPC 至 % (v/v)， 37176。 C 的烘箱中烘烤 4 h 以上。在實(shí)際的操作中應(yīng) 全程戴 1 次性手套和口罩，因?yàn)槠つw上的細(xì)菌和霉菌及口腔中的唾液常常是外源性RNA 酶的重要來源。 西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 22 防御相關(guān)基因的 誘導(dǎo)表達(dá)情況 RNA 專用試劑和耗材的處理 在 RNA 實(shí)驗(yàn)過程中，任何環(huán)節(jié)的不正確操作都可能導(dǎo) 致 RNA 酶的污染。 配法 A： （ mL） B： （ mL）稀釋至 Ml %鄰苯二酚： 取 的 鄰苯二酚 溶至 100Ml,將得到 %鄰苯二酚 溶液。 母液 B： mol/L NaH2PO4 溶液。將 的 Na2HPO4 2) 粗酶液制備 將洗凈的研缽放入冰箱冷凍室（ 20℃）中預(yù)冷 4h，然后將 4g樣品分別放入加有 4ml 的磷酸緩沖提取液的研缽中進(jìn)行研磨，研好的樣品分裝于 的離心管中，并在 10， 000rpm/min 的條件下離心 20min，取上清液即為 PPO 的粗酶液。L移液器 、SG超純水器 、 Sartorius萬分之一電子天平 、 BIORED 熒光定量 PCR儀 實(shí)驗(yàn) 方法 PPO 多酚氧化酶的比活性測定 1) 材料處理 使用 10mM 濃度的葉醇、香葉醇分別噴施在番茄成熟果實(shí)表面，室溫下放置 13 天，同時(shí)利用果盤法，將果實(shí)切片直接暴露于醇溶液中 13天。L移液器 、 北京普析 TU1900雙光束紫外可見分光光度計(jì) 、 Eppendorf Research 100181。 儀器和設(shè)備 研缽 、 容量瓶 、 玻璃棒 、 培養(yǎng)皿 、 10ml離心管 、 刀片 、 膠頭滴管 、 恒西南科技大學(xué)本科生畢業(yè)論文 21 溫箱 、 Eppendorf Research 10181。 TRIZOL： Invitrogen 公司 反轉(zhuǎn)錄 試劑盒： TakaRa 公司。 3 39。 本研究以香葉醇和葉醇誘導(dǎo)的番茄果實(shí)為材料，通過測定果實(shí) 多酚氧化酶活性和防御相關(guān)基因的表達(dá) ，研究了醇誘導(dǎo)下番茄果實(shí)的防御反應(yīng)，為了解番茄果實(shí)的次生代謝及受傷防御反應(yīng)奠定一定的理論基礎(chǔ)。至今，已經(jīng)有了很多的研究表明植物體內(nèi)的水楊酸、茉莉酸、過氧化氫以及乙烯等信號分子在植物的蟲害誘導(dǎo)防御反應(yīng)中起到了重要的作用。這些研究表明植物對害蟲和其他脅迫因子的防御反應(yīng)可能分享相同的信號途徑。鹽度和水分缺失程度的增加正向調(diào)控 LapA 和 Le4 基因的表達(dá)。 外界脅迫因子如水分、鹽度和紫外光等 的脅迫也能影響植物防御害蟲的基因表達(dá)。 其它基因還有一些基因被損傷或昆蟲取食誘導(dǎo)表達(dá)，但是具體的功能未確定。損傷誘導(dǎo)的 AOS 基因表達(dá)的積累需要重新生物合成參與調(diào)控 AOS 基因表達(dá)的信號傳輸途徑的蛋白質(zhì)，而且 AOS mRNA 的積累與茉莉酮酸酯水平的提高相關(guān) [16]。在番茄葉片上，損傷可誘導(dǎo)丙二烯氧化合成酶基因表達(dá) (Sivasankar et al., 2020)，在擬南芥上也有同樣情況 (Laudert and Weiler, 1998)。馬鈴薯中 LOXH3 基