【正文】 取金銀花的陰性對(duì)照顆粒 ,按供試品溶液制備方法制備 ,進(jìn)樣 ,測(cè)定。 線性關(guān)系考察 分別精密吸取對(duì)照品溶液 5 ,10 ,20 ,25 ,30μ L ,按上述色譜條件進(jìn)樣測(cè)定 ,以峰面積積分值 Y 為縱坐標(biāo) ,對(duì)照品量 X(μ g)為橫坐標(biāo) ,作線性回歸 ,得回歸方程 Y = 16789. 186 + 2966111. 589X , r = ,結(jié)果表明 C在 ～ g 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。柱溫 :35176。 ,5μ m) 。供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜相應(yīng)的位置上， 顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)。硅膠 G60 薄 層板 (E. MER2CK) 。 島津 LC210AT系列高效液相色譜儀 ,SPD210A紫外檢測(cè)器 ， CLASS2LC10色譜工作站 。 鑒別 本品為黃酮類化合物，遇濃硫酸有熒光顯示。最后確定優(yōu)化條件為 A2B2C1即煎煮次數(shù)為 2次 。 將正交試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行方差分析 ,結(jié)果見(jiàn)表 3 表 3 煎煮工藝正丁醇浸出物方差 分析 方差來(lái)源 SS f S F P A 2 P B 2 P C 2 P 誤差 D 2 (2,2)=(2,2)= ,A因素中 K2K3K1,故此選擇煎煮次數(shù)為二次 ,B 因素中 K2K1K3,故此選擇煎煮時(shí)間為 1 小時(shí) ,C 因素中 K1K3K2,從極性 R值大小顯示看 ,A因素影響最大 ,C因素次之 ,B因素影響最小 。 二因素和水平選擇 藥材采用水煎煮 ,工藝中主要影響因素為煎煮次數(shù)、煎煮時(shí)間、加水量 ,根據(jù)中藥生產(chǎn)的常規(guī)方法 ,其一般煎煮次數(shù)為 1～ 3 次 ,即 1 次、 2 次、 3 次 ,煎煮時(shí)間為 小時(shí)、 1小時(shí)、 2小時(shí) ,加醇量為 20%、 40%、 60%。若斑點(diǎn)顏 色相同，展開(kāi)位置相同，則原料藥材合格。 供試品溶液的制備 : 取本品粉末約 ，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加 50％甲醇 50ml，稱定重量，超聲處理 30 分鐘，放冷，再稱定重量，用 50％甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，精密量取續(xù)濾液 5ml，置 25ml 棕色量瓶中，加 50％甲醇至刻度，搖勻，即得。 [含量測(cè)定 ]照高效液相色譜法（附錄Ⅵ D）測(cè)定 。 [檢查 ]按《中國(guó)藥典》（ 2021 年版一部附錄Ⅰ D）膠囊項(xiàng)下規(guī)定，對(duì)本品樣品進(jìn)行了檢查，結(jié)果符合規(guī)定。 [鑒別 ]取本品粉末 ，加甲醇 5ml，放置 12 小時(shí)，濾過(guò)，濾液作為供試品溶液。偶見(jiàn)葉狀苞片。金銀花為忍冬科植物忍冬 Lonicera japonica Thunb.、紅腺忍冬 Lonicera hypoglauca Miq.、山銀花 Lonicera confusa Lonicera dasystyla Rehd.的干燥花蕾或帶初開(kāi)的花。表明無(wú)明顯毒性 , 為產(chǎn)品應(yīng)用的安全性 提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 ： 試驗(yàn)結(jié)束時(shí)各劑量組體重、體重增重與對(duì)照組相比無(wú)顯著性差異 (p )。血常規(guī)及生化指標(biāo) : 紅細(xì)胞計(jì)數(shù)、白細(xì)胞計(jì)數(shù)、血紅蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、尿素 氮、肌酐、膽固醇、血糖、總蛋白、白蛋白。試驗(yàn)接受試物推薦用量的 2 50 和 100 倍 , 設(shè) 3 個(gè)劑量組；另設(shè)陰性對(duì)照組，每天上午灌胃一次，按照 1ml\50g高脂乳劑，自由進(jìn)食飲水。 ： 日立 7060C 全自動(dòng)生化分析儀 : Ts212F 生物組織 自動(dòng)脫水機(jī) 。 觀察指針及方法 小鼠的最大耐受量倍 數(shù) :按最大耐受量倍數(shù)公式計(jì)算。 模型組的高密度脂蛋白膽固醇（ HDL）明顯高于空白組 (P),模型 組血清 HDL 值明顯高于藥物 C 組 (P)，模型組和藥物 A、 B、 D、 E、 F組的血清 HDL值沒(méi)有顯著性差異（ P） , 藥物 C 組和空白組的血清 HDL值沒(méi)有明顯差異 (P)如下表 3 表 3 各組大鼠血清膽固醇 (HDL 和 LDL)水平的比較 (X 土 s) 組別 樣品數(shù)量 HDL 值 (mmol\l) LDL 值 (mmol\l) 空白組 10 土 土 模型組 10 士 土 陽(yáng)性對(duì)照組 10 士 土 A 10 士 士 B 9 士 土 C 9 士 土 D 10 士 土 E 8 士 土 F 10 士 土 結(jié)論：化合物 C有明顯降低小鼠低密度脂蛋白膽固醇（ LDL）對(duì)和高密度脂蛋白膽 固醇 （ HDL） ,并且降脂可以降到正常水平 。 六個(gè)化合物對(duì)血 清總膽固醇 (TC)的影響 模型組明顯高于空白組 (P),模型組血清 TC 值明顯高于藥物 C組 (P)，模型組和藥物 A、 B、 D、 E、 F組的血清 TC 值沒(méi)有顯著性差異（ P） , 藥物 C 組和空白組的血清 TC 值沒(méi)有明顯差異 (P)。 血液流變學(xué)的測(cè)定 :用 NxE5 型血液流變儀測(cè)定。 總膽固醇的測(cè)定 :用酶反應(yīng)試劑藥盒測(cè)定。各組均自由飲水，每日更換飲水及飼料，保持動(dòng)物生活環(huán)境通風(fēng)及清潔衛(wèi)生。陽(yáng)性對(duì)照藥為降脂靈片（湖南德海制藥有限公司）批號(hào)： 07060322。 陽(yáng)性對(duì)照： Trolox PG：名稱 propyl gallate，沒(méi)食子酸丙酯 BHA：名稱 Butylated hydroxyanisole，丁基羥基茴香醚 BHT：名稱 Butylated hydroxytoluene，二丁基羥基甲苯 AF 表示單體化合物 LGL 表示：部位 體外實(shí)驗(yàn)結(jié)論：通過(guò)體外活性抗氧化的研究，提示化合物 C有很強(qiáng)的體外抗氧化的活康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計(jì)劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計(jì)劃 第 20 頁(yè) 性，為以后的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步的確證提供很好的體外數(shù)據(jù)，也為接下來(lái)的實(shí)驗(yàn)劑量提供很好的參考。 F 177。 BHT 177。 LGL 177。 E 177。 C 177。 SD) 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計(jì)劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計(jì)劃 第 19 頁(yè) A 1 177。 BHT 177。 SD) PG 177。 177。 LGL 177。 F 177。 177。 177。 177。 C 177。 177。 177。g/ml） RACT5 181。 177。 25 177。 177。 177。 177。g/ml） A 值 (X177。 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計(jì)劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計(jì)劃 第 16 頁(yè) 3 177。 LGL 3 177。 3 177。 3 177。 E 3 177。 3 177。 3 177。 C 3 177。 3 177。 3 177。g/ml） A 3 177。 3 177。 3 177。 3 177。 3 177。 3 177。 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 創(chuàng)業(yè)計(jì)劃書 第四屆挑戰(zhàn)杯 康脂素藥業(yè)有限責(zé)任公司 商業(yè)計(jì)劃 第 14 頁(yè) 試驗(yàn)結(jié)果 DPPH 實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表 1和表 2 由表 2可知，化合物 DPPH法抗氧化活性由大到小依次是 C D E F A B LGL 表 1 陽(yáng)性對(duì)照品清除 DPPH 自由基的半數(shù)抑制濃度 樣本 數(shù) (N) 終濃度 （ 181。 100 式中， Acontrol 為ABTS 本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收， Asample為樣品對(duì) ABTS 作用后的吸收度數(shù)值（除去樣品自身吸收）。 100 式中， Acontrol 為DPPH 本身在測(cè)定波長(zhǎng)的吸收， Asample為樣品對(duì) DPPH 作用后的吸收度數(shù)值（除去樣品自身吸收）。 結(jié)果以 Fe2+當(dāng)量或相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)抗氧化劑的能力來(lái)表示。 NN HN O 2N O 2d i p h e n y l p i c r y l h y d r a z i n e ( n o n r a d i c a l )NNN O 2N O 2d i p h e n y l p i c r y l h y d r a z y l ( f r e e r a d i c a l )+ R H + RO 2 N O 2 N 圖 1 DPPH結(jié)構(gòu)及其還原產(chǎn)物 Structure of DPPH and its reduction by the antioxidant RH （ 2） ABTS 方法及原理 ABTS 是一種水溶性的自由基引發(fā)劑， 該方法就是以此 為顯色劑，經(jīng)活性氧氧化后生成穩(wěn)定的藍(lán)綠色陽(yáng)離子自由基 ABTS?+，向其中加入被測(cè)物質(zhì)，當(dāng)待測(cè)物質(zhì)中含有抗氧化物時(shí)，該物質(zhì)會(huì)與 ABTS?+發(fā)生發(fā)應(yīng)而使反應(yīng)體系顏色褪去，結(jié)構(gòu)式如圖 2所示。故鑒定該化合物結(jié)構(gòu)為 F。 H2NMR(400 MHz,CDCl3):9(3H ,t ,J =),δ (42H),δ (4H) ,δ (2H ,t ,J = Hz)。易溶于氯仿 ,H2NMR(400 MHz,CDCl3 ) :139(3H ,t ,J=) ,δ 1. 25(66H) ,δ 3. 65(2H ,t ,J = )； C2NMR(400 MHz,CDCl3):δ ,18,δ ,δ ,δ ,δ ,δ ,δ ( KBr,cm ):3 395,2919,2850,1738,1613,1467,5,1372,1275,1060,723。溴酚藍(lán)反應(yīng)為陽(yáng)性 ,推測(cè)其為有機(jī)酸類化 合物。 IR(KBr ,cm ) :3484 ,3310 ,2965 ,2840 ,1 679,1604,1532,1443,1367,1306,1279,1246,1188,1109,1045,974,933 ,856； H2NMR(400 MHz ,Acetone2D6 +D2 O):δ (1H ,2d ,J = Hz ,H22) ,δ (1H ,dd ,J= , Hz ,H26) ,δ (1H ,d ,J = Hz,H25) ,δ (1H2 13d,J= Hz ,H27),δ 6. 16(1H,d ,J = ,H28) ,δ 3. 66(3H,s, OCH3 ) ； C2NMR(Acetone2D6 +2D2 O):δ(C21),δ (C22),δ (C23),δ (C24),δ (C25),δ (C26),δ(C27δ (C28),δ ( COOH)。溴