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2025-05-09 03:38 本頁面
【正文】 克隆 (clone)無性繁殖（系） 分子克隆 – DNA的無性繁殖技術(shù) （從 1973年 DNA重組） 重組 DNA技術(shù)包括了基因克隆為主的一系列的分子生物學(xué)操作步驟，實(shí)現(xiàn)不同物種間基因的轉(zhuǎn)移。 為什么 ddNTP可終止鏈的延伸反應(yīng) ？？ 2’， 3’－雙脫氧核酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需的 3’－ OH基團(tuán)。 ① 測序引物 與 單鏈 DNA模板 結(jié)合后。 ?3’ 末端標(biāo)記 :可用 末端轉(zhuǎn)移酶 向核酸的 3’端加上一個(gè)或多個(gè)核苷酸進(jìn)行。 Restriction Mapping The restriction map of the rebinant DNA can be built ① By digestion with restriction enzymes, alone and inconbinations, ② By partial digestion of endlabeled DNA using polynucleotide kinase or terminal transferase， and sizing of fragments produced the restriction map can indicating the clevage position and fragment size. 限制圖譜的構(gòu)建： ①用一種或兩種以上的限制酶對(duì)重組 DNA分子進(jìn)行酶解； ②用限制酶對(duì)末端標(biāo)記的 DNA片段進(jìn)行部分酶解 ,并測定所生成片段的大??； 限制圖譜可標(biāo)明重組 DNA分子的酶切位點(diǎn)和片段大小。 Northern blot 五、 Analysis and uses of cloned DNA 克隆 DNA的鑒定過程包括測定重組 DNA分子的各種特性，如大小、限制圖譜、核苷酸序列、基因的位置及方向。 11 RNase H： 降解 RNADNA異源雙鏈中的 RNA鏈的核酸酶。 7 外切核酸酶 III： 從線性 dsDNA的 3’ 端依次切除核苷酸。 組氨酸標(biāo)簽融合蛋白：在表達(dá)蛋白 ORF的 N端加上一段組氨酸編碼序列，以使重組蛋白可通過與 Ni色譜柱的特異結(jié)合被純化出來。 ? 重組質(zhì)粒中 lacZ 的插入失活將導(dǎo)致不能形成藍(lán)色菌落。 selection Distinguish between the recreated vector and religated vector is very important. 鑒別環(huán)化載體分子與重組質(zhì)粒是分子克隆中非常重要的步驟。 轉(zhuǎn)化率的變動(dòng)幅度從粗放轉(zhuǎn)化程序 103/μg ~ 精細(xì)轉(zhuǎn)化程序 108/μg。 Ligase： 由 ATP水解提供能量，將 dsDNA切口處 5’－磷酸與 3’－ 羥基相結(jié)合 DNA ligation Transformation ?感受態(tài)細(xì)胞 (ponent cell)：用 Ca2+ 溶液處理后易于吸收外源 DNA的大腸桿菌細(xì)胞 。 濃度高 空隙小 ?瓊脂糖凝膠的分辨力 Agrose: a polysaccharide derived from seaweed, which forms a solid gel when dissolved in aqueous solution (%3%) 核酸在凝膠中向正極移動(dòng)？ 核酸具有很強(qiáng)的負(fù)電性 。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān) : 分子量越大，移動(dòng)越慢。 Gel Electrophoresis ① 帶電荷的分子在電場中會(huì)以一定的速率向與其電荷性質(zhì)相反的電極移動(dòng)，速度稱為電泳遷移率 ② 電泳遷移率同電場的強(qiáng)度和分子本身所帶的凈電荷數(shù)目成正比。 ?其發(fā)現(xiàn)及鑒定是實(shí)現(xiàn) DNA克隆的關(guān)鍵。 （現(xiàn)多用各種商品化的層析柱純化 DNA)。 用來中和 NaOH變性液，使 DNA復(fù)性。 ③ EDTA Mg2+、 Ca 2+的螯合劑，可抑制 DNA酶的活性，防止 DNA被酶降解。 ? 堿裂解 染色體線性 DNA和或有缺口的質(zhì)粒 DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì) —SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時(shí)候沉淀下去。 如何提取自己的 DNA? ?在懸浮緩沖液中 重懸細(xì)胞 ； ?溶菌酶 降解細(xì)菌細(xì)胞壁； ?裂解緩沖液中裂解細(xì)胞 ，裂解緩沖液含有 SDS和NaOH, SDS的作用是破碎細(xì)胞膜及引起蛋白質(zhì)變性。端， Taq DNA聚合酶使雜交雙鏈不斷延伸，直至形成新的 DNA雙鏈 原理： 在試管中，利用 DNA聚合酶、一對(duì)引物和四種dNTP，對(duì)模板 DNA反復(fù)多次地進(jìn)行復(fù)制，從而得到大量擴(kuò)增產(chǎn)物的反應(yīng)過程。 該技術(shù)高效、快捷、特異性好。 ?質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理 ampr基因編碼 β－ 內(nèi)酰胺酶 ，降解青霉素類抗生素如氨芐青霉素。 ?生物學(xué)特征： （ 1）分子量?。?2～ 200kb，多個(gè)拷貝。 整合是通過質(zhì)粒與受體細(xì)胞中同源序列間發(fā)生的同源重組介導(dǎo)的。 ?Host anism/cell: where the plasmids get multiplied and propagated faithfully, which is crucial for DNA cloning. ?Hosts for DNA cloning vector Prokaryotic host : E. coli ( most cases) Eukaryotic host : Yeast (Saccharomyces cerevisiae), large fragments of human genome Host cell 宿主細(xì)胞 Vector（載體） 在基因工程操作中，把能攜帶外源 DNA進(jìn)入受體細(xì)胞的 DNA分子叫載體。 Ge
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