基因操作ppt課件(參考版)
2025-05-15 03:38本頁(yè)面
【正文】 從研發(fā)到進(jìn)入市場(chǎng)，需要的周期長(zhǎng)，至少 5年以上 基因工程技術(shù)是現(xiàn)代生物技術(shù)的基礎(chǔ) 重組 DNA操作的一般步驟： 1）獲得需要的 目的基因 （又稱外源基因）； 2） 目的基因在限制性內(nèi)切酶和連接酶作用下與載體連接，形成新的重組 DNA分子（ 克隆和篩選 ）； 3） 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 ： 用重組的 DNA分子轉(zhuǎn)化受體細(xì)胞，使之進(jìn)入受體細(xì)胞并能在受體細(xì)胞中復(fù)制和遺傳； 4） 對(duì)轉(zhuǎn)化子即獲得外源基因的受體細(xì)胞進(jìn)行 篩選和鑒定 ； (陽(yáng)性克隆 ) 5）對(duì)獲得外源基因的細(xì)胞或生物體通過發(fā)酵、細(xì)胞培養(yǎng)、養(yǎng)殖或栽培等，最終獲得所需的遺傳性狀或表達(dá)出所需要的產(chǎn)物。 重組 DNA技術(shù)的重大突破帶動(dòng)了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起 ，并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè) 。 Sanger反應(yīng)需要的組分 ？？ DNA模板； DNA聚合酶； 標(biāo)記的測(cè)序引物； dNTP。 ③再用 PAGE分析四組樣品 。 ② DNA聚合酶 用 dNTP延伸引物。 ① The sequencing primer is annealed to a ssDNA template molecule ； ② a DNA polymerase extends the primer using dNTP. The extension reaction is split into four and each quarter is terminated separatly with one of the four specific ddNTP； ③ the four samples are analyzed by PAGE. ?Sanger的酶法 ： 原理： 雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子。 ?均勻標(biāo)記 ：需用 聚合酶完成一條完整的被標(biāo)記鏈 。ATP的 γ磷酸 是用來標(biāo)記的標(biāo)記源。 Combinational enzyme digestion Partial digestion ?Labeling nucleic acid ?5’ － end labeling :require polynucleotide kinase (多聚核苷酸激酶 )to add a phosphate to nucleic acid with a free 5’OH,which can be created by dephosphoprylation using alkaline phosphatase (堿性磷酸酶 ). The external –phosphate of ATP is the source of the label. ?3’－ end labeling :require the terminal transferase (末端轉(zhuǎn)移酶 )to add one or more nucleotides to the 3’－ end of nucleic acid. ?Uniform labeling: require polymerases（ 聚合酶 ） to synthesize a plete labeled strand. 5’ 末端標(biāo)記 :可用 多核苷酸激酶 將具放射活性的磷酸加到具有 游離 5 ’ － OH的核酸上。 agarose gel electrophoresis with the molecular weight marker 1 應(yīng)用限制酶切、瓊脂糖凝膠電泳及分子量標(biāo)準(zhǔn)可確定克隆DNA片段的大小。 純 DNA樣品的制備 是克隆 DNA鑒定的第一步。用放射性同位素（ 32P或 125I）標(biāo)記的 DNA或 RNA探針 . hybridization 用 DNA（或 RNA）探針檢測(cè) DNA樣品 Southern blot DNA的制備 限制性酶切 瓊脂糖凝膠電泳 Southern blot 篩選結(jié)果 用 DNA（或 RNA）探針檢測(cè) RNA樣品。 四、 Screening library－ Searching the genes of interest in a DNA library ?通過雜交篩選目標(biāo)基因 放射性或熒光標(biāo)記的 DNA探針是與目的基因序列的某一區(qū)段互補(bǔ)或部分互補(bǔ)的一段 DNA。 10 RNase A： 只降解 RNA， 而不降解 DNA 的核酸酶。 8 綠豆核酸酶：降解單鏈核酸，留下完整的雙螺旋區(qū)段。 6 末端轉(zhuǎn)移酶：向線性單鏈或雙鏈 DNA或 RNA的 3’ OH添加核苷酸 。 三、 Enzyme for DNA cloning Alkaline phophatse 堿性磷酸酶 ? removes the phosphate groups from the 5’ends of the vector DNA linearized by a single restriction enzyme to prevent the selfligation of the vector DNA upon the followed ligation ? Single restriction enzyme directed cloning ?去除線性載體分子 5‘末端的磷酸基團(tuán)，使載體在沒有目的片段插入的情況下不能自連成環(huán)狀，從而降低反應(yīng)物中載體自身環(huán)化的比例。其產(chǎn)生的融合蛋白是由來自 lacZ’的 N端的幾個(gè)氨基酸及其緊連著的由插入片段所編碼的蛋白序列組成。 IPTG： 異丙基 β D硫代半乳糖苷 . 是乳糖的類似物。 當(dāng) 菌株表達(dá) Lac阻抑物時(shí)，則載體上的 lacZ 基因由 IPTG誘導(dǎo)表達(dá) ， 表達(dá)形成的酶可利用底物 Xgal一種形成藍(lán)色化合物。 ?雙抗生素抗性篩選 ?藍(lán)－白斑篩選 ?Twin antibiotic resistance
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