基因操作ppt課件-展示頁
2025-05-21 03:38本頁面
【正文】 以互補(bǔ)的方式依次把 dNTP加至引物的3180。 ? 小試管中反應(yīng)需加入 4種物質(zhì)： （ 1）作為模板的 DNA序列－－即微量的總 DNA； （ 2）與欲分離的目的基因兩條鏈的各自 5’ 端序列相互補(bǔ)的DNA引物（約 20個(gè)左右堿基的短 DNA單鏈）； （ 3） Taq DNA聚合酶； （ 4） 4種核苷酸 4 dNTP（即 dATP, dTTP, dGTP和 dCTP） ? 1985年， Mullis DNA復(fù)制過程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù) 。 二、 Technology 1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR技術(shù)） 2. Plasmid preparation（ 質(zhì)粒的提?。? 3. Restriction digests（ 限制性酶切） 4. Agarose gel electrophoresis （ 瓊脂糖凝膠電泳） 5. DNA ligation（ 連接） 6. Transformation（ 轉(zhuǎn)化） 7. Selection（ 篩選） ? 就是在體外的小試管中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段 目的基因 DNA的技術(shù)。 tetA基因編碼一種跨膜泵蛋白 ，能從細(xì)胞內(nèi)將四環(huán)素類抗生素排出。 SC OC L L SC ? 質(zhì)粒載體的一般特征： ① 獨(dú)立于宿主基因組的 自主復(fù)制 DNA； ② 易于 從宿主細(xì)胞中 分離 出來； ③至少包含一個(gè) 選擇標(biāo)記 ，即一個(gè)能使含有該載體的宿主可以從不含該載體的細(xì)胞中篩選出來絕 ④含有 多克隆位點(diǎn) MCS ； ⑤分子量小，拷貝數(shù)多。 （ 2）復(fù)制起點(diǎn) ：自主復(fù)制； （ 3）編碼基因少 ：其中有（ 抗生素抗性基因 ） Plasmid(質(zhì)粒 ) （ 4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型： ① 共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（ SC）（ super coil） ② 開環(huán) DNA（ open circular， ocDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。 存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。 ?細(xì)菌整合載體（根癌農(nóng)桿菌 Tｉ質(zhì)?？杀挥脕韺?DNA整合到植物基因組中） ?酵母整合載體 ?哺乳動(dòng)物整合載體：病毒為基礎(chǔ)（以病毒的天然感染為基礎(chǔ)，可用于基因治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。 表達(dá)載體的結(jié)構(gòu) 表達(dá)載體元件 啟動(dòng)基因 P 核糖體結(jié)合位點(diǎn) ORF 終止子 (3) Integration vectors整合載體： 允許外源 DNA插入，并在轉(zhuǎn)化后整合到宿主細(xì)胞基因組中。 ?細(xì)菌表達(dá)載體 ?酵母表達(dá)載體 ?哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 ? Types of vector(載體的類型 ) (1) Cloning vector 克隆載體 ： 可以插入、保存外源DNA， 并在 DNA水平上進(jìn)行操作 大腸桿菌克隆載體： 質(zhì)粒、 噬菌體 (λ ＆ M13)、 黏粒 即質(zhì)粒－噬菌體的雜合體 細(xì)菌人工染色體（ BAC） 酵母克隆載體： 酵母人工染色體（ YAC） (2) Expression vector 表達(dá)載體： 可使外源基因插入和表達(dá)。 cDNA libraries（ cDNA文庫）： 細(xì)胞全部 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和。 ?用基因組 DNA的隨機(jī)片段制備成的； ?用基因組文庫克隆某一基因，效率極低。 ?ｍ RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA后，插入克隆載體構(gòu)建成； ?用 cDNA文庫克隆目的基因是有效的，但克隆的僅是編碼區(qū)，而不包含編碼區(qū)以外的基因組序列。 ②用限制性內(nèi)切核酸酶將質(zhì)粒 酶切 成不連續(xù)的片段 ③ 經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳 分離片段 ④ 純化目標(biāo)片段 ⑤ 將目標(biāo)片段 連接 在新質(zhì)粒載體上，形成新重 組分子 ⑥將連接好的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 某一大腸桿菌菌株 ⑦ 轉(zhuǎn)化細(xì)菌的 篩選 ⑧重組質(zhì)粒的 分析 ?最常見的亞克隆程序 : DNA文庫 DNA文庫：一套 DNA克隆，每個(gè)克隆都是插入了不同片段的載體在宿主中擴(kuò)增后的產(chǎn)物。 亞克?。簩⒁芽寺〉?DNA片段從一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的過程稱為亞克隆。一頭成熟的猛犸，身長達(dá) 5米，體高約 3米，與亞洲象相近，門齒長 ，雖然身高不高，但身體肥碩，因而體重可達(dá) 6~8噸。 猛犸象曾經(jīng)是世界上最大的象。這一系列操作過程就稱為 DNA克隆?；虿僮? Gene manipulation An overview of DNA cloning Some conception need to know Some useful technology for gene manipulation Enzymes for DNA cloning Vectors 一、 Conception DNA克隆 ：將 目的基因連接到載體上 ，形成通?？梢栽诹硪凰拗骷?xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的 重組DNA。 帶有重組 DNA的宿主細(xì)胞的增殖構(gòu)成了一群具有遺傳一致性的 個(gè)體 ，或稱為 克隆 。 ? 科學(xué)家從一具 提取出高品質(zhì) DNA。它身高體壯，有粗壯的腿，腳生四趾，頭特別大，在其嘴部長出一對(duì)彎曲的大門牙。它身上披著黑色的細(xì)密長毛，皮很厚，具有極厚的脂肪層，厚度可達(dá) 9厘米。 ?亞克隆可用來對(duì)較大的克隆片段上較短區(qū)斷進(jìn)行仔細(xì)研究； ?將基因轉(zhuǎn)移到能在特定物種中表達(dá)的另一載體上； Subcloning(亞克隆 ) ① 含有目標(biāo)克隆序列的 質(zhì)粒 DNA的提取 。 克隆：一個(gè)遺傳上獨(dú)立的個(gè)體或一群相同的個(gè)體。 Genomic libraries（基因組文庫）： 整套由基因組 DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆的總和。因?yàn)榇罅緿NA是非
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