《基因操作》ppt課件-全文預(yù)覽
【正文】 input plasmid DNA. Ranges from 103/μg to more than 108/μg. 105/μg is adequate for a simple cloning. ?Heatshock: After the DNA is uptaken, the cells shall be put at 42oC for 1 min in order to induce the suppressed enzymes for cell defending ， which allow the cells to recover from the unusual condition of the transformation progress, and increase the efficiency. 轉(zhuǎn)化效率：每毫升用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA在選擇平板上所形成的具抗生素抗性的菌落數(shù)。 在有 5’末端磷酸基團(tuán)時(shí)， DNA連接酶可共價(jià)連接互補(bǔ)配對(duì)的黏性末端或平頭末端。 瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。 ⑤ 如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同： 電泳的基本原理 電泳遷移率主要取決于分子本身的大小和形狀。新形成的 5’ P, 3’ － OH。 centrifugation pellet cell CsCL gradient purification Restriction digests ? Identified in the 1960s and early 1970s ? Bacterial enzymes which cut DNA into defined and reproducible fragments ? Key discovery which allowed the DNA cloning to bee a reality ?20世紀(jì) 60年代和 70年代初鑒定 ?來自細(xì)菌，可將 DNA酶切成特定的、可再生的片段。但苯酚會(huì)殘留在 DNA溶液中。 （ 2） 所用的試劑作用 ⑤ NaAcHAc緩沖液 冰醋酸把醋酸鈉溶液的 pH調(diào)到 5。 ② 葡萄糖 增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止 DNA受機(jī)械力（震蕩）的作用而降解。超螺旋質(zhì)粒 DNA易復(fù)性 ； 染色體 DNA不能復(fù)性。 體內(nèi)復(fù)制與 PCR技術(shù)的區(qū)別 ? PCR技術(shù)的發(fā)明 PCR的發(fā)明是 DNA操作技術(shù)的革命 美國(guó) Kary Mullis教授 開汽車時(shí)的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路 ——DNA雙螺旋 行駛的汽車 ——一小段 DNA引物 …… 1988年發(fā)明了 PCR技術(shù) 1993年獲得諾貝爾獎(jiǎng) 2. Plasmid mini－ preparation from E. coli ?小量制備質(zhì)粒 DNA： ①含質(zhì)粒大腸桿菌細(xì)胞的 培養(yǎng) ； ② 離心 菌液 收集 菌體 沉淀 ； ③堿裂解： 懸浮細(xì)胞沉淀，堿裂解，中和 ； ④ 酚抽提 去除蛋白雜質(zhì)； ⑤ 乙醇沉淀核酸 。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 按照模板鏈的序列以互補(bǔ)的方式依次把 dNTP加至引物的3180。 二、 Technology 1. 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（ PCR技術(shù)） 2. Plasmid preparation（ 質(zhì)粒的提?。? 3. Restriction digests（ 限制性酶切） 4. Agarose gel electrophoresis （ 瓊脂糖凝膠電泳） 5. DNA ligation（ 連接） 6. Transformation（ 轉(zhuǎn)化） 7. Selection（ 篩選） ? 就是在體外的小試管中通過酶促反應(yīng)有選擇地大量擴(kuò)增（包括分離）一段 目的基因 DNA的技術(shù)。 SC OC L L SC ? 質(zhì)粒載體的一般特征： ① 獨(dú)立于宿主基因組的 自主復(fù)制 DNA； ② 易于 從宿主細(xì)胞中 分離 出來； ③至少包含一個(gè) 選擇標(biāo)記 ，即一個(gè)能使含有該載體的宿主可以從不含該載體的細(xì)胞中篩選出來絕 ④含有 多克隆位點(diǎn) MCS ； ⑤分子量小，拷貝數(shù)多。 存在于細(xì)菌、霉菌、藍(lán)藻、酵母等細(xì)胞中。 表達(dá)載體的結(jié)構(gòu) 表達(dá)載體元件 啟動(dòng)基因 P 核糖體結(jié)合位點(diǎn) ORF 終止子 (3) Integration vectors整合載體： 允許外源 DNA插入，并在轉(zhuǎn)化后整合到宿主細(xì)胞基因組中。 cDNA libraries（ cDNA文庫(kù)）： 細(xì)胞全部 mRNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA并被克隆的總和。 ?ｍ RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA后，插入克隆載體構(gòu)建成； ?用 cDNA文庫(kù)克隆目的基因是有效的，但克隆的僅是編碼區(qū)，而不包含編碼區(qū)以外的基因組序列。 亞克?。簩⒁芽寺〉?DNA片段從一個(gè)載體轉(zhuǎn)移到另一個(gè)載體的過程稱為亞克隆。 猛犸象曾經(jīng)是世界上最大的象?；虿僮? Gene manipulation An overview of DNA cloning Some conception need to know Some useful technology for gene manipulation Enzymes for DNA cloning Vectors 一、 Conception DNA克隆 ：將 目的基因連接到載體上 ，形成通常可以在另一宿主細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行復(fù)制的 重組DNA。 ? 科學(xué)家從一具 提取出高品質(zhì) DNA。它身上披著黑色的細(xì)密長(zhǎng)毛，皮很厚，具有極厚的脂肪層，厚度可達(dá) 9厘米。 克?。阂粋€(gè)遺傳上獨(dú)立的個(gè)體或一群相同的個(gè)體。因?yàn)榇罅緿NA是非編碼序列。具
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