基因操作ppt課件(存儲版)
【正文】 agarose gel electrophoresis with the molecular weight marker 1 應(yīng)用限制酶切、瓊脂糖凝膠電泳及分子量標(biāo)準(zhǔn)可確定克隆DNA片段的大小。 ① The sequencing primer is annealed to a ssDNA template molecule ； ② a DNA polymerase extends the primer using dNTP. The extension reaction is split into four and each quarter is terminated separatly with one of the four specific ddNTP； ③ the four samples are analyzed by PAGE. ?Sanger的酶法 ： 原理： 雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子。 重組 DNA技術(shù)的重大突破帶動了現(xiàn)代生物技術(shù)的興起 ，并很快產(chǎn)生了許多生命科學(xué)的高技術(shù)產(chǎn)業(yè) 。 Sanger反應(yīng)需要的組分 ？？ DNA模板； DNA聚合酶； 標(biāo)記的測序引物； dNTP。 ?均勻標(biāo)記 ：需用 聚合酶完成一條完整的被標(biāo)記鏈 。 純 DNA樣品的制備 是克隆 DNA鑒定的第一步。 8 綠豆核酸酶：降解單鏈核酸，留下完整的雙螺旋區(qū)段。 IPTG： 異丙基 β D硫代半乳糖苷 . 是乳糖的類似物。 熱激 ： 42oC熱激 1~2分鐘 。 ① 檢測 DNA ②分離、純化目的 DNA片段 ③分析重組質(zhì)粒 應(yīng)用 凝膠染色 染料 溴化乙錠 Ethidium bromide （ EB） 原理 ?扁平分子，能插入 DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。 ③ 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 ⑦乙醇：用于沉淀 DNA。 ④ NaOHSDS NaOH：強堿，提供 pH12的堿性條件，使 DNA雙鏈變性。 NaOH的作用是使 DNA變性 。 ? 小試管中反應(yīng)需加入 4種物質(zhì)： （ 1）作為模板的 DNA序列－－即微量的總 DNA； （ 2）與欲分離的目的基因兩條鏈的各自 5’ 端序列相互補的DNA引物（約 20個左右堿基的短 DNA單鏈）； （ 3） Taq DNA聚合酶； （ 4） 4種核苷酸 4 dNTP（即 dATP, dTTP, dGTP和 dCTP） ? 1985年， Mullis DNA復(fù)制過程的核酸體外擴增技術(shù) 。 （ 2）復(fù)制起點 ：自主復(fù)制； （ 3）編碼基因少 ：其中有（ 抗生素抗性基因 ） Plasmid(質(zhì)粒 ) （ 4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型： ① 共價閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（ SC）（ super coil） ② 開環(huán) DNA（ open circular， ocDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個缺口。 ?細(xì)菌表達(dá)載體 ?酵母表達(dá)載體 ?哺乳動物表達(dá)載體 ? Types of vector(載體的類型 ) (1) Cloning vector 克隆載體 ： 可以插入、保存外源DNA， 并在 DNA水平上進(jìn)行操作 大腸桿菌克隆載體： 質(zhì)粒、 噬菌體 (λ ＆ M13)、 黏粒 即質(zhì)粒－噬菌體的雜合體 細(xì)菌人工染色體（ BAC） 酵母克隆載體： 酵母人工染色體（ YAC） (2) Expression vector 表達(dá)載體： 可使外源基因插入和表達(dá)。 ②用限制性內(nèi)切核酸酶將質(zhì)粒 酶切 成不連續(xù)的片段 ③ 經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳 分離片段 ④ 純化目標(biāo)片段 ⑤ 將目標(biāo)片段 連接 在新質(zhì)粒載體上，形成新重 組分子 ⑥將連接好的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 某一大腸桿菌菌株 ⑦ 轉(zhuǎn)化細(xì)菌的 篩選 ⑧重組質(zhì)粒的 分析 ?最常見的亞克隆程序 : DNA文庫 DNA文庫：一套 DNA克隆，每個克隆都是插入了不同片段的載體在宿主中擴增后的產(chǎn)物。這一系列操作過程就稱為 DNA克隆。它身高體壯，有粗壯的腿，腳生四趾，頭特別大，在其嘴部長出一對彎曲的大門牙。 Genomic libraries（基因組文庫）： 整套由基因組 DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆的總和。 整合是通過質(zhì)粒與受體細(xì)胞中同源序列間發(fā)生的同源重組介導(dǎo)的。 ?質(zhì)粒的選擇標(biāo)記及其工作原理 ampr基因編碼 β－ 內(nèi)酰胺酶 ，降解青霉素類抗生素如氨芐青霉素。端， Taq DNA聚合酶使雜交雙鏈不斷延伸，直至形成新的 DNA雙鏈 原理： 在試管中，利用 DNA聚合酶、一對引物和四種dNTP，對模板 DNA反復(fù)多次地進(jìn)行復(fù)制，從而得到大量擴增產(chǎn)物的反應(yīng)過程。 ? 堿裂解 染色體線性 DNA和或有缺口的質(zhì)粒 DNA變性后雙鏈分離，難以復(fù)性而形成纏繞的結(jié)構(gòu)，與蛋白質(zhì) —SDS復(fù)合物結(jié)合在一起，在離心的時候沉淀下去。 用來中和 NaOH變性液，使 DNA復(fù)性。 ?其發(fā)現(xiàn)及鑒定是實現(xiàn) DNA克隆的關(guān)鍵。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān) : 分子量越大，移動越慢。 Ligase： 由 ATP水解提供能量，將 dsDNA切口處 5’－磷酸與 3’－ 羥基相結(jié)合 DNA ligation Transformation ?感受態(tài)細(xì)胞 (ponent cell)：用 Ca2+ 溶液處理后易于吸收外源 DNA的大腸桿菌細(xì)胞 。 selection Dis
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