【正文】 很強的負電性 。 ? 重組質(zhì)粒中 lacZ 的插入失活將導(dǎo)致不能形成藍色菌落。 Northern blot 五、 Analysis and uses of cloned DNA 克隆 DNA的鑒定過程包括測定重組 DNA分子的各種特性，如大小、限制圖譜、核苷酸序列、基因的位置及方向。 為什么 ddNTP可終止鏈的延伸反應(yīng) ？？ 2’， 3’－雙脫氧核酸在脫氧核糖上沒有聚合酶延伸鏈所需的 3’－ OH基團。 ① 測序引物 與 單鏈 DNA模板 結(jié)合后。 11 RNase H： 降解 RNADNA異源雙鏈中的 RNA鏈的核酸酶。 selection Distinguish between the recreated vector and religated vector is very important. 鑒別環(huán)化載體分子與重組質(zhì)粒是分子克隆中非常重要的步驟。 形狀相似的分子的遷移速度主要與分子量相關(guān) : 分子量越大，移動越慢。 用來中和 NaOH變性液，使 DNA復(fù)性。端， Taq DNA聚合酶使雜交雙鏈不斷延伸，直至形成新的 DNA雙鏈 原理： 在試管中，利用 DNA聚合酶、一對引物和四種dNTP，對模板 DNA反復(fù)多次地進行復(fù)制，從而得到大量擴增產(chǎn)物的反應(yīng)過程。 整合是通過質(zhì)粒與受體細胞中同源序列間發(fā)生的同源重組介導(dǎo)的。它身高體壯，有粗壯的腿，腳生四趾，頭特別大，在其嘴部長出一對彎曲的大門牙。 ②用限制性內(nèi)切核酸酶將質(zhì)粒 酶切 成不連續(xù)的片段 ③ 經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳 分離片段 ④ 純化目標(biāo)片段 ⑤ 將目標(biāo)片段 連接 在新質(zhì)粒載體上，形成新重 組分子 ⑥將連接好的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 某一大腸桿菌菌株 ⑦ 轉(zhuǎn)化細菌的 篩選 ⑧重組質(zhì)粒的 分析 ?最常見的亞克隆程序 : DNA文庫 DNA文庫：一套 DNA克隆，每個克隆都是插入了不同片段的載體在宿主中擴增后的產(chǎn)物。 （ 2）復(fù)制起點 ：自主復(fù)制； （ 3）編碼基因少 ：其中有（ 抗生素抗性基因 ） Plasmid(質(zhì)粒 ) （ 4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型： ① 共價閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（ SC）（ super coil） ② 開環(huán) DNA（ open circular， ocDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個缺口。 NaOH的作用是使 DNA變性 。 ⑦乙醇：用于沉淀 DNA。 ① 檢測 DNA ②分離、純化目的 DNA片段 ③分析重組質(zhì)粒 應(yīng)用 凝膠染色 染料 溴化乙錠 Ethidium bromide （ EB） 原理 ?扁平分子，能插入 DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。 IPTG： 異丙基 β D硫代半乳糖苷 . 是乳糖的類似物。 純 DNA樣品的制備 是克隆 DNA鑒定的第一步。 Sanger反應(yīng)需要的組分 ？？ DNA模板； DNA聚合酶； 標(biāo)記的測序引物； dNTP。 ① The sequencing primer is annealed to a ssDNA template molecule ； ② a DNA polymerase extends the primer using dNTP. The extension reaction is split into four and each quarter is terminated separatly with one of the four specific ddNTP； ③ the four samples are analyzed by PAGE. ?Sanger的酶法 ： 原理： 雙脫氧核苷酸作為鏈終止試劑，通過聚合酶的引物延伸產(chǎn)生一系列大小不同的分子。 10 RNase A： 只降解 RNA， 而不降解 DNA 的核酸酶。有利于細胞從轉(zhuǎn)化過程中的不正常狀態(tài)下恢復(fù)過來，提高轉(zhuǎn)化效率。 ⑤ 如果電場強度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同： 電泳的基本原理 電泳遷移率主要取決于分子本身的大小和形狀。 （ 2） 所用的試劑作用 ⑤ NaAcHAc緩沖液 冰醋酸把醋酸鈉溶液的 pH調(diào)到 5。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 按照模板鏈的序列以互補的方式依次把 dNTP加至引物的3180。 表達載體的結(jié)構(gòu) 表達載體元件 啟動基因 P 核糖體結(jié)合位點 ORF 終止子 (3) Integration vectors整合載體： 允許外源 DNA插入，并在轉(zhuǎn)化后整合到宿主細胞基因組中。 猛犸象曾經(jīng)是世界上最大的象。 克?。阂粋€遺傳上獨立的個體或一群相同的個體。 ③ 線形 DNA （ linear ， lDNA） （ 5）質(zhì)粒空間構(gòu)型與電泳速率 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： scDNA最快、 L DNA次之、 ocDNA最慢。 ?中和 ：中和緩沖液含 KOAc (pH 5)， 其作用是沉淀已變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA及大部分去污劑。 DNA分子以水合狀態(tài) “ 溶于 ” 水里，乙醇能奪去 DNA分子的水環(huán)境。 ?EB在 300nm紫外光照射下能 發(fā)紅色熒光 ，即可顯示 DNA泳帶在凝膠中所處的位置 . ?熒光強度與 DNA含量及大小成正比。能誘導(dǎo) lac操縱子的啟動轉(zhuǎn)錄， Xgal ： 5－溴－ 4－氯－ 3－吲哚－ β － D－ 半乳糖苷 Fusion protein Lac融合蛋白：插入片段與 lacZ’基因具相同的可讀框，且是連續(xù)的 。