基因操作ppt課件-wenkub
2023-05-27 03:38:11 本頁(yè)面
【正文】 nomic libraries（基因組文庫(kù)）： 整套由基因組 DNA片段插入克隆載體獲得的分子克隆的總和。 ?亞克隆可用來(lái)對(duì)較大的克隆片段上較短區(qū)斷進(jìn)行仔細(xì)研究； ?將基因轉(zhuǎn)移到能在特定物種中表達(dá)的另一載體上； Subcloning(亞克隆 ) ① 含有目標(biāo)克隆序列的 質(zhì)粒 DNA的提取 。它身高體壯，有粗壯的腿，腳生四趾，頭特別大，在其嘴部長(zhǎng)出一對(duì)彎曲的大門(mén)牙。 帶有重組 DNA的宿主細(xì)胞的增殖構(gòu)成了一群具有遺傳一致性的 個(gè)體 ，或稱(chēng)為 克隆 。這一系列操作過(guò)程就稱(chēng)為 DNA克隆。一頭成熟的猛犸，身長(zhǎng)達(dá) 5米，體高約 3米，與亞洲象相近，門(mén)齒長(zhǎng) ，雖然身高不高，但身體肥碩，因而體重可達(dá) 6~8噸。 ②用限制性?xún)?nèi)切核酸酶將質(zhì)粒 酶切 成不連續(xù)的片段 ③ 經(jīng)瓊脂糖 凝膠電泳 分離片段 ④ 純化目標(biāo)片段 ⑤ 將目標(biāo)片段 連接 在新質(zhì)粒載體上，形成新重 組分子 ⑥將連接好的質(zhì)粒 轉(zhuǎn)化 某一大腸桿菌菌株 ⑦ 轉(zhuǎn)化細(xì)菌的 篩選 ⑧重組質(zhì)粒的 分析 ?最常見(jiàn)的亞克隆程序 : DNA文庫(kù) DNA文庫(kù)：一套 DNA克隆，每個(gè)克隆都是插入了不同片段的載體在宿主中擴(kuò)增后的產(chǎn)物。 ?用基因組 DNA的隨機(jī)片段制備成的； ?用基因組文庫(kù)克隆某一基因，效率極低。 ?細(xì)菌表達(dá)載體 ?酵母表達(dá)載體 ?哺乳動(dòng)物表達(dá)載體 ? Types of vector(載體的類(lèi)型 ) (1) Cloning vector 克隆載體 ： 可以插入、保存外源DNA， 并在 DNA水平上進(jìn)行操作 大腸桿菌克隆載體： 質(zhì)粒、 噬菌體 (λ ＆ M13)、 黏粒 即質(zhì)粒－噬菌體的雜合體 細(xì)菌人工染色體（ BAC） 酵母克隆載體： 酵母人工染色體（ YAC） (2) Expression vector 表達(dá)載體： 可使外源基因插入和表達(dá)。 ?細(xì)菌整合載體（根癌農(nóng)桿菌 Tｉ質(zhì)?？杀挥脕?lái)將 DNA整合到植物基因組中） ?酵母整合載體 ?哺乳動(dòng)物整合載體：病毒為基礎(chǔ)（以病毒的天然感染為基礎(chǔ)，可用于基因治療、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物等。 （ 2）復(fù)制起點(diǎn) ：自主復(fù)制； （ 3）編碼基因少 ：其中有（ 抗生素抗性基因 ） Plasmid(質(zhì)粒 ) （ 4）質(zhì)粒的空間構(gòu)型： ① 共價(jià)閉合環(huán)狀 DNA（ cccDNA) Covalent close circular DNA 呈超螺旋（ SC）（ super coil） ② 開(kāi)環(huán) DNA（ open circular， ocDNA） 一條鏈上有一至數(shù)個(gè)缺口。 tetA基因編碼一種跨膜泵蛋白 ，能從細(xì)胞內(nèi)將四環(huán)素類(lèi)抗生素排出。 ? 小試管中反應(yīng)需加入 4種物質(zhì)： （ 1）作為模板的 DNA序列－－即微量的總 DNA； （ 2）與欲分離的目的基因兩條鏈的各自 5’ 端序列相互補(bǔ)的DNA引物（約 20個(gè)左右堿基的短 DNA單鏈）； （ 3） Taq DNA聚合酶； （ 4） 4種核苷酸 4 dNTP（即 dATP, dTTP, dGTP和 dCTP） ? 1985年， Mullis DNA復(fù)制過(guò)程的核酸體外擴(kuò)增技術(shù) 。 變性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm5?C DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈分子作為反應(yīng)的模板 引物與模板互補(bǔ)結(jié)合，形成雜交鏈 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～ 30 次循環(huán)后，模板 DNA的含量可以擴(kuò)大 100萬(wàn)倍以上。 NaOH的作用是使 DNA變性 。 （ 1）原理： ① 溶菌酶 能水解菌體細(xì)胞壁的主要化學(xué)成分肽聚糖中的 ?1， 4糖苷鍵。 ④ NaOHSDS NaOH：強(qiáng)堿，提供 pH12的堿性條件，使 DNA雙鏈變性。 高濃度的 NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、 DNA、 RNA等）沉淀。 ⑦乙醇：用于沉淀 DNA。 ?Restriction endonuclease ?限制性?xún)?nèi)切核酸酶 ： 存在于細(xì)菌細(xì)胞中的一種識(shí)別一小段對(duì)稱(chēng)的 DNA序列，在識(shí)別位點(diǎn)處切割（水解）雙鏈DNA骨架的酶。 ③ 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。 瓊脂糖凝膠電泳 ?瓊脂糖 一種線(xiàn)性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來(lái)。 ① 檢測(cè) DNA ②分離、純化目的 DNA片段 ③分析重組質(zhì)粒 應(yīng)用 凝膠染色 染料 溴化乙錠 Ethidium bromide （ EB） 原理 ?扁平分子，能插入 DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。 用于制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞是不能表達(dá)限制修飾系統(tǒng)的特定菌株。 熱激 ： 42oC熱激 1~2分鐘 。 ?雙抗生素抗性篩選 ?藍(lán)－白斑篩選 ?Twin antibiotic resistance ?Bluewhite screening ?半乳糖苷酶 Xgal顯色反應(yīng) ?半乳糖苷酶能把無(wú)色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一個(gè)深藍(lán)色的物質(zhì) 5溴 4氯靛藍(lán)。 IPTG： 異丙基 β D硫代半乳糖苷 . 是乳糖的類(lèi)似物。 三、 Enzyme for DNA cloning Alkaline phophatse 堿性磷酸酶 ? rem
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