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【正文】 ddNTP. ?Sequence database ? sequence database online ? 美國生物工程信息中心（ GenBank) ? 基因組序列數(shù)據(jù)庫（ GSDB:Genome sequence database) ? 歐洲分子生物學(xué)研究所（ EMBL ) ? 日本 DNA數(shù)據(jù)庫（ DDBJ:DNA data bank of Japan) ? sequence database software (DNA club、GCG、 DNAman) 以克隆和重組 DNA為核心的技術(shù)即基因工程技術(shù) ， 又稱為 重組DNA技術(shù) 。 Nucleic acid sequencing ?DNA sequencing ? Maxam and Gilbert chemical method ?Sanger’s enzymic method ?Sanger’s enzymic method Dideoxynucleotides as chain terminators produces a ladder of molecules generated by polymerase extension of primer； then PAGE separates the molecular。 Characterization（ 鑒定 ） of cloned DNA The size of the cloned DNA can be determined by restriction digestion amp。 9 核酸酶 S1： 降解對(duì)應(yīng)于互補(bǔ)鏈缺口對(duì)面的單鏈。能誘導(dǎo) lac操縱子的啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄， Xgal ： 5－溴－ 4－氯－ 3－吲哚－ β － D－ 半乳糖苷 Fusion protein Lac融合蛋白：插入片段與 lacZ’基因具相同的可讀框，且是連續(xù)的 。誘導(dǎo)與 DNA修復(fù)有關(guān)的酶及其它細(xì)胞成分的生成。 ?EB在 300nm紫外光照射下能 發(fā)紅色熒光 ，即可顯示 DNA泳帶在凝膠中所處的位置 . ?熒光強(qiáng)度與 DNA含量及大小成正比。 ④ 摩擦系數(shù)主要與分子的大小、形狀以及介質(zhì)的粘度有關(guān)。 DNA分子以水合狀態(tài) “ 溶于 ” 水里，乙醇能奪去 DNA分子的水環(huán)境。 SDS: 溶解細(xì)胞膜蛋白和細(xì)胞內(nèi)蛋白，并結(jié)合成 “ 蛋白 —SDS”復(fù)合物，使蛋白質(zhì)（包括 DNA酶）變性沉淀。 ?中和 ：中和緩沖液含 KOAc (pH 5)， 其作用是沉淀已變性的蛋白質(zhì)和染色體 DNA及大部分去污劑。 ? 1988年，美國 PEcetus公司推出世界上第一臺(tái) PCR熱循環(huán)儀，從而使 PCR反應(yīng)自動(dòng)化； ? 1993年， Kary mullis因發(fā)明 PCR技術(shù)獲得諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)； ? 1995年，定量 PCR儀誕生，使定量研究 DNA靶序列成為現(xiàn)實(shí)。 ③ 線形 DNA （ linear ， lDNA） （ 5）質(zhì)?？臻g構(gòu)型與電泳速率 同一質(zhì)粒盡管分子量相同，不同的構(gòu)型電泳遷移率不同： scDNA最快、 L DNA次之、 ocDNA最慢。具有 RNA轉(zhuǎn)錄所需的啟動(dòng)子和終止子。 克?。阂粋€(gè)遺傳上獨(dú)立的個(gè)體或一群相同的個(gè)體。 ? 科學(xué)家從一具 提取出高品質(zhì) DNA。 猛犸象曾經(jīng)是世界上最大的象。 ?ｍ RNA反轉(zhuǎn)錄合成 cDNA后，插入克隆載體構(gòu)建成； ?用 cDNA文庫克隆目的基因是有效的，但克隆的僅是編碼區(qū)，而不包含編碼區(qū)以外的基因組序列。 表達(dá)載體的結(jié)構(gòu) 表達(dá)載體元件 啟動(dòng)基因 P 核糖體結(jié)合位點(diǎn) ORF 終止子 (3) Integration vectors整合載體： 允許外源 DNA插入，并在轉(zhuǎn)化后整合到宿主細(xì)胞基因組中。 SC OC L L SC ? 質(zhì)粒載體的一般特征： ① 獨(dú)立于宿主基因組的 自主復(fù)制 DNA； ② 易于 從宿主細(xì)胞中 分離 出來； ③至少包含一個(gè) 選擇標(biāo)記 ，即一個(gè)能使含有該載體的宿主可以從不含該載體的細(xì)胞中篩選出來絕 ④含有 多克隆位點(diǎn) MCS ； ⑤分子量小，拷貝數(shù)多。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 按照模板鏈的序列以互補(bǔ)的方式依次把 dNTP加至引物的3180。超螺旋質(zhì)粒 DNA易復(fù)性 ； 染色體 DNA不能復(fù)性。 （ 2） 所用的試劑作用 ⑤ NaAcHAc緩沖液 冰醋酸把醋酸鈉溶液的 pH調(diào)到 5。 centrifugation pellet cell CsCL gradient purification Restriction digests ? Identified in the 1960s and early 1970s ? Bacterial enzymes which cut DNA into defined and reproducible fragments ? Key discovery which allowed the DNA cloning to bee a reality ?20世紀(jì) 60年代和 70年代初鑒定 ?來自細(xì)菌，可將 DNA酶切成特定的、可再生的片段。 ⑤ 如果電場(chǎng)強(qiáng)度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同： 電泳的基本原理 電泳遷移率主要取決于分子本身的大小和形狀。 在有 5’末端磷酸基團(tuán)時(shí)， DNA連接酶可共價(jià)連接互補(bǔ)配對(duì)的黏性末端或平頭末端。有利于細(xì)胞從轉(zhuǎn)化過程中的不正常狀態(tài)下恢復(fù)過來，提高轉(zhuǎn)化效率。其產(chǎn)生的融合蛋白是由來自 lacZ’的 N端的幾個(gè)氨基酸及其緊連著的由插入片段所編碼的蛋白序列組成。 10 RNase A： 只降解 RNA， 而不降解 DNA 的核酸酶。
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