【正文】 ...G A A T T C... 3‘ 3‘…C T T A A G... 5‘ EcoRI 3. 限制酶的命名 ? 宿主 屬名第一字母、種名頭兩個(gè)字母 ? 菌株或型號(hào) ? 序號(hào) 羅馬字 HindII EcoRI 早前 加 R, or M 菌株號(hào)和序號(hào)小寫 1986年下半年 發(fā)現(xiàn) 615R 98M 1998年 10000細(xì)菌 古細(xì)菌 3000種酶 200多特異性 3. 限制與修飾系統(tǒng)的種類 亞單位組成 , 識(shí)別序列的種類 , 是否需要輔助因子 分三類 (I, II ,III) 也有分四類， IIs類，即 II 亞類 (1) type II 93% 識(shí)別回文對(duì)稱序列，在回文序列內(nèi)部或附近切割 3’OH,5’P， 需 Mg2+，相應(yīng)的修飾酶需 only SAM 識(shí)別序列主要為 46bp， 或更長(zhǎng)且呈二重對(duì)稱的特殊序列 但有少數(shù)酶識(shí)別更長(zhǎng)的序列或簡(jiǎn)并序列 切割位置因酶而異，有些是隔開的 R : 一般為同源二聚體 , 反向結(jié)合 作用在兩條鏈 M: 單體 DNA同時(shí)切割 , M只作用新鏈 type IIs 占 5% 識(shí)別位點(diǎn)非對(duì)稱 , 非間斷 47bp 切割位點(diǎn)可能在 20bp范圍內(nèi)?；? 因 操 作 原 理 Principles of Gene Manipulation 緒論 一、什么是基因操作 ? 將在細(xì)胞外產(chǎn)生的核酸分子 ? 插入病毒質(zhì)?；蚱渌d體系統(tǒng)中 ? 再整合到那些本來不含該類物質(zhì)的宿主中 ? 從而形成一種新的可連續(xù)繁殖的有機(jī)體 目的 要求掌握 ? 基因操作中基本的普遍應(yīng)用的原理 ? 并能自主設(shè)計(jì)通用操作方法和策略 要求的基礎(chǔ) 生物學(xué) 生物化學(xué) 分子生物學(xué) 參考書籍 １ . Molecular Cloning , 1989 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南 2. 基因工程原理 第二版（上冊(cè)） 吳乃虎 科學(xué)出版社 1998/2022 3. 分子生物學(xué)試劑產(chǎn)品目錄 如 New England BioLabs 其它 基因及其操作原理 精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南 Inter １．基因及其產(chǎn)物的共線性 ２．基因及其產(chǎn)物的 非 共線性 ３．基因的重疊與可變性 二、基因的基本概念 ? 編碼區(qū) ORF ? 啟動(dòng)子 promoter ? RBS ribosomal binding site ? 終止區(qū) terminator ? flanking sequence upstream / downstream ? Cap/tail 三、基因的基本結(jié)構(gòu)組成 酶切 酶切 連接 轉(zhuǎn)化 篩選 ...GAATTC... ...CTTAAG... ...G ...CTTAA AATTC... G... EcoRI 三、基因克隆的通用策略 Chromosome DNA vector Rebinant plasmids Target gene 第二章 工具酶 ? 切割位點(diǎn)可為獲得 DNA的物理圖的特殊的標(biāo)記 ? 利用限制性內(nèi)切酶切割產(chǎn)生特殊 DNA片段的能力使得純化那些 DNA片段成為可能 ? 獲得的限制性 DNA片段可作為 DNA操作中的基本介質(zhì) 第一節(jié) 限制性內(nèi)切酶 Restriction endonuclease 任何物種都有 排除異物保護(hù)自身的防御機(jī)制 免疫系統(tǒng) 細(xì)菌的限制與修飾系統(tǒng) 限制性內(nèi)切酶 修飾酶 一、限制與修飾 Restriction and modification 50年代初，發(fā)現(xiàn) host controlled specificity ?噬菌體具有代表性和普遍性 其在不同宿主中的轉(zhuǎn)染頻率， ?在感染某一宿主后，再去感染其它宿主時(shí)受到限制的現(xiàn)象。 E. coli K E. coli C EOP=1 EOP=1 EOP=1 EOP=104 1. 現(xiàn)象 EOP Efficiency of plate pfu plaque forming unit K B C ?K ?B ?C 1 1 1 104 104 104 104 1 1 說明 K和 B菌株中存在一種限制系統(tǒng) 可排除外來的 DNA 104的存活率是由宿主修飾系統(tǒng)作用的結(jié)果 甲基化： A N6甲基 腺膘呤 C 5?甲基胞嘧啶 2. 限制酶的發(fā)現(xiàn) 60年代，限制內(nèi)切酶和限制酶的概念 1968年 首次從 K中分離限制性內(nèi)切酶 需要 ATP， S腺苷甲硫氨酸（ SAM）等 有特定的識(shí)別位點(diǎn) 但沒有特定的切割位點(diǎn) 切割位點(diǎn)達(dá)離識(shí)別位點(diǎn) 1000bp以上 1970年 美國(guó)約翰 R: 與 type II 具有相同的輔助因子要求 M: 通常由兩個(gè) M來完成 ,各作用一條鏈 (2) type I 和 typeIII type I (1%) 種類少 如 EcoR EcoB R酶和 M酶 各作為一個(gè)亞基存在于酶分子中 即 R基和 M亞基，還有負(fù)責(zé)識(shí)別 DNA序列的 S亞基 分別由 hsdR， hsd M， hsdS基因編碼 屬于同一操縱子（轉(zhuǎn)錄單位） EcoK R2M2S EcoB R2M4S2 P1—hsdR—P2—hsdM—hsdS 識(shí)別位點(diǎn) EcoB TGA*(N)8TGCT A* EcoK AAC (N6)GTGC A * 甲基化位點(diǎn) 176。 176。 pIprefix 三、限制性內(nèi)切酶產(chǎn)生的末端 Cohesive terminus (end) 1. 匹配粘端 (粘性末端） 末端相同 ① 在對(duì)稱軸 5‘側(cè)切割底物 DNA雙鏈交錯(cuò)斷開 →5‘protruding EcoRI …NNGAATTCNN… …NNCTTAAGNN… …NNG AATTCNN… …NNCTTAA GNN… ② 3‘側(cè) →3‘突出末端 5? recessed KpnI GGTACC CCATGG Blunt end 在對(duì)稱軸上同時(shí)切割 DNA的兩條鏈 HaeIII GG↓CC EcoRV GAT↓ATC XmnI GAANN↓NNTTC (相同 ) ① 來自非對(duì)稱識(shí)別序列 CCTCAGC BbvCI GGAGTCG ② 簡(jiǎn)并序列 AccI GT/MKAC GTATAC GTAGAC GTCTAC GTCGAC ③ 間隔序列 DraIII CACNNNGTG EarI CTC T TC (1/4) GAGAAG (isoschizomer) 識(shí)別相同序列的限制酶稱同裂酶 ① 同序同切 HindII HincII GTY/RAC HpaII HpaII C/CGG MobI Sau3AI /GATC 同功酶？ ② 同序異切 KpnI GGTAC/C Acc65I G/GTACC Asp718I G/GTACC AatII GACGT/C BsaHI GR/CGYC ③ ―同功多位” EcoRI G/AATTC ApoI R/AATTY HpaI GTT/AAC HincII GTY/RAC ④ 其它 SalI G/TCGAC AccI GT/MKAC HincII GTY/RAC 酶 平端 同裂酶 EcoRI GAATTC MfeI CAATTG ApoI RAATTY SpeI NheI XbaI StyI A C T A G T G C T A G C T C T A G A C C W W G G BamHI GGATCC Sau3AI GATC ClaI ATCGAT AccI GTMKAC pUC19 BstBI TTCGAA TaqI TCGA 四、末端長(zhǎng)度對(duì)切割的影響 指導(dǎo)雙酶切以及酶切 PCR產(chǎn)物 2hr 20hr AccI CCGGTCGACCGG 0 0 HindIII CAAGCTTG 0 0 CCAAGCTTGG 0 0 CCCAAGCTTGGG 10% 75% EcoRI GGAATTCC 90 90 利用 Labeled 寡核苷酸 在 20 Units RE 時(shí) 酶切 1 ug oligo 1. Labeled 寡核苷酸 PstI GCTGCAGC 0 0 TGCACTGCAGTGCA 10 10 AACTGCAG(N) 14 90 90 CTGCAG(N) 20 0 0 2. DNA片段（線性載體） 10?/ug DNA 60min CGTACG CTCGAG GAATTC CTGCAG GATATC EcoRI L1TMUS29 XhoI 100% (1) PstI 88(1) CTCGAG GAATTC CTGCAG XhoI EcoRI PstI ...CTCGAGGAATTCCTGCAG... ...GAGCTCCTTAAGGACGTC... XhoI EcoRI PstI EcoRI initial cut L1TMUS29 cleavage efficiency XhoI 97% 1 base PstI 37% 1 base XhoI : 1 EcoRI 100% PstI : 1 EcoRI 88% L1TMU39 NheI 100(1) GGATCC GAATTC GCTAGC BamHI EcoRI NheI 由于不計(jì)算單鏈部分的 4個(gè)堿基，因此設(shè)計(jì)引物時(shí)應(yīng)加 4個(gè)。1975 EcoRI切割 ? phage中的 5個(gè)位點(diǎn)，并不是