基因操作ppt課件-文庫吧資料
2025-05-18 03:38本頁面
【正文】 ?Bluewhite screening ?半乳糖苷酶 Xgal顯色反應 ?半乳糖苷酶能把無色的化合物 Xgal分解成半乳糖和一個深藍色的物質(zhì) 5溴 4氯靛藍。有利于細胞從轉(zhuǎn)化過程中的不正常狀態(tài)下恢復過來，提高轉(zhuǎn)化效率。 熱激 ： 42oC熱激 1~2分鐘 。 ? Transformantion efficiency: number of antibioticresistant colonies formed （ on a select plate）per microgram (mg) of input plasmid DNA. Ranges from 103/μg to more than 108/μg. 105/μg is adequate for a simple cloning. ?Heatshock: After the DNA is uptaken, the cells shall be put at 42oC for 1 min in order to induce the suppressed enzymes for cell defending ， which allow the cells to recover from the unusual condition of the transformation progress, and increase the efficiency. 轉(zhuǎn)化效率：每毫升用于轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒 DNA在選擇平板上所形成的具抗生素抗性的菌落數(shù)。 用于制備感受態(tài)的大腸桿菌細胞是不能表達限制修飾系統(tǒng)的特定菌株。 在有 5’末端磷酸基團時， DNA連接酶可共價連接互補配對的黏性末端或平頭末端。 ① 檢測 DNA ②分離、純化目的 DNA片段 ③分析重組質(zhì)粒 應用 凝膠染色 染料 溴化乙錠 Ethidium bromide （ EB） 原理 ?扁平分子，能插入 DNA堿基之間，但不與瓊脂糖結(jié)合。 瓊脂糖的濃度決定凝膠的空隙（密度）。 瓊脂糖凝膠電泳 ?瓊脂糖 一種線性多糖聚合物，從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來。 ⑤ 如果電場強度一定（電壓和電極距離）、電泳介質(zhì)相同： 電泳的基本原理 電泳遷移率主要取決于分子本身的大小和形狀。 ③ 電泳遷移率同分子與介質(zhì)的摩擦系數(shù)成反比。新形成的 5’ P, 3’ － OH。 ?Restriction endonuclease ?限制性內(nèi)切核酸酶 ： 存在于細菌細胞中的一種識別一小段對稱的 DNA序列，在識別位點處切割（水解）雙鏈DNA骨架的酶。 centrifugation pellet cell CsCL gradient purification Restriction digests ? Identified in the 1960s and early 1970s ? Bacterial enzymes which cut DNA into defined and reproducible fragments ? Key discovery which allowed the DNA cloning to bee a reality ?20世紀 60年代和 70年代初鑒定 ?來自細菌，可將 DNA酶切成特定的、可再生的片段。 ⑦乙醇：用于沉淀 DNA。但苯酚會殘留在 DNA溶液中。 高濃度的 NaAc有利于變性的大分子（蛋白質(zhì)、 DNA、 RNA等）沉淀。 （ 2） 所用的試劑作用 ⑤ NaAcHAc緩沖液 冰醋酸把醋酸鈉溶液的 pH調(diào)到 5。 ④ NaOHSDS NaOH：強堿，提供 pH12的堿性條件，使 DNA雙鏈變性。 ② 葡萄糖 增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止 DNA受機械力（震蕩）的作用而降解。 （ 1）原理： ① 溶菌酶 能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的 ?1， 4糖苷鍵。超螺旋質(zhì)粒 DNA易復性 ； 染色體 DNA不能復性。 NaOH的作用是使 DNA變性 。 體內(nèi)復制與 PCR技術(shù)的區(qū)別 ? PCR技術(shù)的發(fā)明 PCR的發(fā)明是 DNA操作技術(shù)的革命 美國 Kary Mullis教授 開汽車時的聯(lián)想 逶迤崎嶇的山路 ——DNA雙螺旋 行駛的汽車 ——一小段 DNA引物 …… 1988年發(fā)明了 PCR技術(shù) 1993年獲得諾貝爾獎 2. Plasmid mini－ preparation from E. coli ?小量制備質(zhì)粒 DNA： ①含質(zhì)粒大腸桿菌細胞的 培養(yǎng) ； ② 離心 菌液 收集 菌體 沉淀 ； ③堿裂解： 懸浮細胞沉淀，堿裂解，中和 ； ④ 酚抽提 去除蛋白雜質(zhì)； ⑤ 乙醇沉淀核酸 。 變性 95?C 延伸 72?C 退火 Tm5?C DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，形成單鏈分子作為反應的模板 引物與模板互補結(jié)合，形成雜交鏈 5? Primer 1 5? Primer 2 Cycle 2 Cycle 1 5? 5? 5? 5? 5? 5? Template DNA 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? Cycle 3 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 5? 25～ 30 次循環(huán)后，模板 DNA的含量可以擴大 100萬倍以上。 The Nobel Prize in Chemistry 1993 PCR技術(shù)的誕生與發(fā)展 按照模板鏈的序列
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