20xx年醫(yī)學專題—人重組白細胞介素-8在大腸桿菌的表達、鑒定-資料下載頁
2025-11-10 05:08本頁面
【正文】 聚體及發(fā)夾結(jié)構的能值過高（）易導致產(chǎn)生引物二聚體帶，并且降低引物有效濃度而使PCR反應不能正常進行。對引物的修飾一般是在5’端增加酶切位點，應根據(jù)下一步實驗中要插入PCR產(chǎn)物的載體的相應序列而確定。而本試驗酶切位點設計在下游3’引物上，并且增加了ccg三個堿基來保護酶切位點，是酶切更高效[3]。把PCR產(chǎn)物和提取的質(zhì)粒DNA進行限制性內(nèi)切酶消化，然后進行DNA的連接。將hlL8cDNA片段插入pKpL3α質(zhì)粒中，有三種方法可選。一是兩個平端連接；二是兩個粘端連接；三是一個平端和一個粘端連接。分析這三種連接方法，第一種方法優(yōu)點是設計簡單，但是缺點也很明顯，連接反應慢、片段位置易倒置、容易形成多個重復序列等。第二種方法優(yōu)點是連接緊密，特異性高，但酶切位點設計比較復雜。所以綜合以上情況，本實驗采用第三種辦法。3’端用Klenow酶補齊，5’端用XbaⅠ進行酶切，使之產(chǎn)生互補粘端。經(jīng)過轉(zhuǎn)化處理后，小批量誘導hlL8表達，經(jīng)純化后，進行ELISA雙抗體夾心法檢測，由圖2可以大致估算出hlL8的濃度[4]。另外，經(jīng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌在LA平皿上進行培養(yǎng)，長出的大腸桿菌說明其細胞均內(nèi)含有質(zhì)粒，但不能說明其質(zhì)粒中都含有目的基因片段。所以要對培養(yǎng)出的大腸桿菌做進一步的鑒定。由于本實驗沒有做這一步，所以有必要在這里討論一下。挑單個菌落接種于1ml LA培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)后可進一步提取質(zhì)粒進行DNA電泳；或者用限制性內(nèi)切酶酶切后進行DNA電泳，看是否含有目的基因片段。還可以小批量誘導重組IL8表達，然后進行SDSPAGE電泳，鑒定重組蛋白的分子量。本試驗成功地構建了hlL18重組原核表達質(zhì)粒，利用大腸桿菌成功地表達了重組蛋白，為進一步研究hIL18的功能及應用打下了基礎。參考文獻[1] 張成崗，賀福初. 生物信息學方法與實踐[M]. 北京：科學出版社，2002, 64,66.[2] 賀林. 解碼生命人類基因組計劃和后基因組計劃[M]. 北京：科學出版社，2000, 346348.[3] 張新宇，高燕寧. 生物信息學[J]. 2004(04): 1619.[4] 分子免疫學實驗指導.內(nèi)容總結(jié)
（1）人重組白細胞介素8在大腸桿菌的表達、鑒定
【摘要】目的 利用PCR技術擴增hIL8 cDNA，將其連接于原核表達載體pKpL3a（含PL啟動子）中,并在大腸桿菌中表達、鑒定
（2）10000rpm，10分鐘離心，棄上清， 70%乙醇，10000rpm，5分鐘離心，棄上清，空氣中干燥，溶于20μl TE
（3）加10μl連接好的質(zhì)粒DNA，混勻，冰浴30分鐘，37℃水浴2分鐘，冰浴2分鐘
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